蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ?n,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体。酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸)。谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K_1值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L。γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38％。     

蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ricini,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体.酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸).谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K₁值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L.Γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38%.     

γ-谷氨酰转肽酶产生菌的筛选和培养条件的研究

从土壤中筛选分离到一株产γ-谷氨酰转肽酶的菌株,经生理生化特性鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subti-lis)NX-2。产酶条件研究表明,葡萄糖是最佳的碳源,酵母膏为最佳氮源,当采用1．5％酵母膏,1．0％玉米浆复合氮源,菌体产γ-谷氨酰转肽酶活力达到3．2U／mL。分析NX-2菌生长和产酶的进程,发现γ-谷氨酰转肽酶的合成与菌体生长是同步的。     

γ-谷氨酰转肽酶活性电泳染色新方法

目的：建立一种新的电泳活性染色方法,以快速地对活性电泳中γ-谷氨酰转肽酶（GGT）进行显色,从而准确鉴定和定位该酶,并可用于该酶的电泳法纯化制备。方法：低温下,样品活性电泳结束后立即将浸有γ-L-谷氨酰-α-萘氨和双甘肽混合底物溶液的滤纸贴在胶面上反应5min,然后再用浸有对氨基苯磺酸和亚硝酸钠混合显色液的滤纸覆盖在基质滤纸上显色。结果：在滤纸上很快显示出一条红色条带,经切胶酶促反应检验确定为GGT,经电泳法和高效液相色谱法确定GGT达到了电泳纯。结论：该法快速、灵敏、简单、直观,为GGT的鉴定和纯化提供了一条新思路。     

家兔血清酶谱观察

最近,我们选用了三种蛋白代谢酶(谷-草转氨酶、谷-丙转氨酶、γ-谷氨酰转肽酶),二种脂代谢酶(碱性磷酸酶、胆碱酯酶)和一种糖代谢酶(乳酸脱氢酶)组成酶谱,并结合蛋白电泳相及肝脏组织化学检查,对家兔进行了观察,意在为常用实验动物家兔的生化指标提供参考。材料与方法一、动物来源:由市场选购体重2公斤以上的健康家兔14只,用麦麸及新鲜蔬菜饲养,观察2周后从心脏采血进行测定。二、血清酶活性测定:谷-草转氨酶(GOT)及谷-丙转氨酶(GPT)的测定采用改良金氏法。γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)用对硝基苯胺法。碱性磷酸酶(AKP)用氨基安替比林比色法…     

家蚕中的5-氧脯氨酸酶及保幼激素类似物对它的影响

本工作首次在家蚕Bombyx mori的马氏管、中肠、丝腺及脂肪体等组织中测到了γ-谷氨酰循环中一个关键酶——5-L-氧脯氨酸酶的活力.该酶以马氏管中活力最高,在蚕的中肠、血淋巴中均存在有游离的5-氧脯氨酸.观察了保幼激素类似物(JHA)处理后,家蚕中肠、丝腺和脂肪体中5-L-氧脯氨酸酶活力的变化,同时观察了血淋巴中5-氧脯氨酸含量的变化.对该酶及γ-谷氨酰循环在蚕体中氨基酸转运上的可能作用进行了讨论.     

家蚕中的5-氧脯氨酸酶及保幼激素类似物对它的影响

本工作首次在家蚕Bombyx mori的马氏管、中肠、丝腺及脂肪体等组织中测到了γ-谷氨酰循环中一个关键酶——5-L-氧脯氨酸酶的活力.该酶以马氏管中活力最高,在蚕的中肠、血淋巴中均存在有游离的5-氧脯氨酸.观察了保幼激素类似物(JHA)处理后,家蚕中肠、丝腺和脂肪体中5-L-氧脯氨酸酶活力的变化,同时观察了血淋巴中5-氧脯氨酸含量的变化.对该酶及γ-谷氨酰循环在蚕体中氨基酸转运上的可能作用进行了讨论.     

蓖麻蚕γ-谷氨酰转肽酶的研究

L-γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)广泛分布在蓖麻蚕Philosamia cynthia ricinI的中肠、马氏管、后丝腺、脂肪体、体壁等组织中;并存在于蚕个体发育中的各个阶段。酶活力以马氏管、中肠为最大。在五龄蚕前中期各组织均显示γ-GTP最大活力。在脂肪体和表皮组织中,蛹形成时又分别出现γ-GTP活力峰。昆虫生长发育必需的10种氨基酸均是蚕各组织γ-GTP酶促反应的受体。这些结果表明,γ-GTP作为L-γ-谷氨酰循环中一个关键酶,在蓖麻蚕体内对氨基酸的吸收和转运起着重要作用。     

γ谷氨酰环化转移酶对斑马鱼早期发育的影响

γ谷氨酰环化转移酶(γ-Glutamyl cyclotransferase,GGCT)是谷胱甘肽循环过程中催化L-γ-GlutamylL-amino acid分解为L-amino acid和5-oxoprodline的关键酶,在防止细胞氧化性损伤中发挥重要作用。研究以斑马鱼为模型,利用吗啡啉(Morpholino,MO)敲降GGCT,发现早期胚胎发育出现脑部发育缓慢、尾短弯曲和环心室水肿等异常表型,原位杂交检测发现脑发育相关标记基因shha、wnt8b与fgf8的表达发生改变。体外转录ggct-m RNA与GGCT-MO共注射,畸形率降低,部分脑部标记基因表达回复正常。此外,使用化学阻断剂阻断GGCT上游的γ谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpeptidase,GGT)和下游的5羟脯氨酸酶,斑马鱼胚胎产生发育停滞和水肿表型。敲降GGCT和阻断GGT都降低了胚胎的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的含量,研究表明γ谷氨酰环化转移酶可能通过谷胱甘肽循环在斑马鱼早期胚胎发育过程发挥重要作用。     

用Bacillus subtilis NX-2菌株谷氨酰转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽

S-苄基-谷胱甘肽是合成谷胱甘肽的一种重要前体化合物。以L-谷氨酰胺为供体,S-苄基-半胱氨酰甘氨酸为受体．用Bacillus subtilis NX-2的γ-谷氨酰转肽酶催化进行转肽反应,合成得到S-苄基-谷胱甘肽。该化合物进行了质谱及核磁共振分析,并得到了初步鉴定。     

血清γ-谷氨酰转肽酶活力的简易微量测定

正常人血清γ-谷氨酰转肽酶的活力很低。在急性肝炎,肝癌和梗阻性黄疸等患者中,血清γ-谷氨酰转肽酶活力显著升高,可高达正常人血清中活力的100倍。因此对于肝胆系统疾病的诊断有一定意义,与其他酶活力测定等配合也有助于肝癌的诊断。     

γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究

利用PCR技术以Bacillus subtilis SYU 20016基因组DNA为模板,扩增出1.8kb编码γ-谷氨酰基转肽酶的基因ggt,将其连接到温控表达载体pBV220,得到重组载体pBV220-ggt,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为65kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有ggt的基因工程菌进行表达研究表明：发酵的培养温度为30℃,pH为7.2,装液量为20mL(在250mL的锥形瓶中)的条件下42℃诱导4h后,重组菌的γ-谷氨酰基转肽酶酶活力达到6U/mL,目前报道的非基因工程菌（枯草芽孢杆菌NX-2）酶活力最高仅为3.2U/mL。     

蓖麻蚕芳基酰酰胺酶的研究

芳基酰酰胺酶(E.C.3,5,1,13)为水解N-酰基芳香胺的酶,本工作对该酶在蓖麻蚕个体发育中的活力变化及其性质进行了观察和研究,结果如下:ⅰ)该酶存在于蚕个体发育中的各个阶段,广泛分布在蚕体内各组织。在中肠、马氏管组织的活力在熟蚕时最大,结茧后明显下降。在五龄中前期,蛹中后期,脂肪体和真皮的酶活力均出现高峰,以蛹中后期活力最高。该酶在中枢神经系统中有相当高的活力,在后部丝腺、蚕卵都显示活力,但血淋巴中没有可检出的活力。ⅱ)蓖麻蚕各组织的芳基酰酰胺酶,绝大部分活力存在于细胞浆。对N-乙酰对硝基苯胺容易水解,但对γ-谷氨酰对硝基苯胺和γ-谷氨酰α-萘胺均不能水解。钙、钴阳离子能促进酶活力;瞟呤霉素有明显抑制酶活力的作用,但L-γ-谷氨酸(0-羧基)苯肼无抑制作用。从该酶在蚕体广泛分布,并随变态而活力有明显变化以及对底物芳香胺N-乙酰基团显示特异性等特点来看,它可能具有多种功能,并与芳香胺的代谢有关。     

模拟谷胱甘肽过氧化物酶活性三肽的制备及其性质研究

开发一种制备硒代谷胱甘肽（ＧＳｅＨ）的新方法,以合成的谷氨酰－γ丝氨酰－甘氨酸（Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ）三肽为原料,经苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）活化,用Ｈ２Ｓｅ突变Ｓｅｒ成硒代半胱氨酸（ＳｅＣｙｓ）制成ＧＳｅＨ．用元素分析及氨基酸分析确定此三肽的组成并推导出此三肽的结构,研究了ＧＳｅＨ的性质,结果表明,此三肽具有谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＰＸ）的活性,其活力比其它一些小分子有机模拟物高,在性质上出有于它     

载体两性电解质修饰对固定化γ-谷氨酰转肽酶pH耐受性和催化活性的影响

针对γ-谷氨酰转肽酶(GGT)p H耐受性差的缺陷,首先以硅烷化改性的介孔氧化钛晶须(s MTw)为载体对重组枯草芽胞杆菌GGT进行固定化,再以p H 8.0~10.5的载体两性电解质Pharmalyte(CA,p H 8.0~10.5)对其进行后修饰,得到固定化酶s MTw-GGT-CA。结果发现:s MTw-GGT-CA的p H耐受性较游离酶明显提高,可在p H 6.0~11.0范围内保持稳定的催化活性。同时,s MTw-GGT-CA的热稳定性也较游离酶有所提高,其最适作用温度为50℃左右,热失活反应活化能Ed为49.88 k J/mol。s MTw-GGT-CA对γ-谷氨酰对硝基苯胺(Gp NA)的亲和力常数Km为0.579 mmol/L,与游离酶相近。     

大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜消化酶活性的比较

采用酶学分析的方法,研究了大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜的麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖酶、纤维二糖酶、碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等8种消化酶的活性。结果表明:1)大弹涂鱼肠Ⅱ刷状缘膜的麦芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶、海藻糖酶和纤维二糖酶等5种二糖酶的比活力均显著高于肠Ⅰ和肠Ⅲ(P<0·05);中华乌塘鳢肠Ⅰ刷状缘膜除乳糖酶外,其余4种二糖酶的比活力均显著高于肠Ⅱ和肠Ⅲ(P<0·05);大弹涂鱼肠Ⅲ碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等3种消化酶的比活力均显著高于肠Ⅰ和肠Ⅱ(P<0·05);中华乌塘鳢肠Ⅱ的这3种消化酶的比活力均显著高于肠Ⅰ和肠Ⅲ(P<0·05);2)大弹涂鱼各段肠刷状缘膜的5种二糖酶的比活力均显著高于中华乌塘鳢(P<0·05),前者肠刷状缘膜碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等3种消化酶的比活力整体上也稍微高于后者。由此说明:8种消化酶的活性在大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜中的分布模式明显不同,大弹涂鱼和中华乌塘鳢对二糖的消化和吸收的主要部位分别是在肠Ⅱ和肠Ⅰ,而二者对蛋白质、脂类和无机盐等营养吸收的主要部位分别是在肠Ⅲ和肠Ⅱ;大弹涂鱼和中华乌塘鳢肠刷状缘膜的5种二糖酶的活性与两者的食性关系密切,而碱性磷酸酶、氨基肽酶和γ-谷氨酰转肽酶等3种消化酶的活性与两者的食性并无密切的相关性。     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的催化性质

 通过测定海枣曲霉β-半乳糖苷酶的底物特异性,表明该酶水解对-硝基酚基β-半乳糖苷(PNP-β-gal)的活力最高。该酶水解PNP-β-gal,乳糖和对-硝基酚基β-D-岩藻糖苷(PNP-β-fuc)的相对活力为100,63.1,10.3。不同测定方法的结果均表明,这一PNP-β-fuc水解活性来自β-半乳糖苷酶本身。Hg~(2+)、D-半乳糖和D-半乳糖-r-内酯对该酶有强烈的抑制作用,Ag~+和4mol/l脲也有较强的抑制作用。该酶水解PNP-β-gal和乳糖的Km值分别为1.3及36.2mmol/l,Vmax则分别为478和189μmol.min~(-1).mg~(-1)。Lineweaver-Burk作图法及Dixon作图法均表明D-半乳糖和D-半乳糖酸-γ-内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为4和0.9mmol/l。     

γ-谷氨酰转肽酶在大肠杆菌周质空间的双融合表达

设计引物PCR扩增大肠杆菌Escherichia coli DH5α的γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)成熟肽的编码基因,利用基因拼接(gene splicing by overlap extension,SOE)技术将其拼接至小分子泛素相关修饰物(the small ubiquitin-related modifier,SUMO)基因的下游,并重组至pET-39b质粒中,重组质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3)。得到的工程菌经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,全菌SDS-PAGE分析,得到表观分子量约为97×103的双融合蛋白,DNA测序进一步证实工程菌构建成功。以菌体直接催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸,纸层析法证实该重组酶具有较好的活性,为酶法生产L-茶氨酸奠定基础。     

人类红细胞膜γ-谷氨酰转移酶活性探讨

肝、肾、血清等组织中的γ-谷氨酰转移酶(γ-GT,EC2.3.2.2)已有广泛深入的研究,而红细胞中γ-GT的研究很少,红细胞膜γ-GT活性更鲜为人知。本文用γ-谷氨酰-α-萘胺为基质探讨人类红细胞膜是否有γ-GT活性,以及在某些生理情况和病理情况是否会有差异。     

大熊猫乳中酶的活力与激素含量分析

测定了两只大熊猫乳中几种酶的活力和激素浓度,并与成都麻羊和中国荷斯坦牛乳进行了比较。脱脂乳中γ-谷氨酰转肽酶、乳过氧化物酶活力明显低于牛乳,而淀粉酶活力高于牛乳,N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶活力与牛乳接近;两只大熊猫乳中均检测到较高浓度的胰岛素和生长激素,胰岛素含量明显高于牛乳,T3和IGF-I含量显著低于成都麻羊乳。