日本蛇根草花青素还原酶基因的克隆及其生物信息学分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase, ANR)是原花青素合成途径中的关键酶,同时花青素还原酶对植物花色苷的积累也发挥着重要作用。本研究以日本蛇根草为材料,以其转录组测序结果为基础,设计引物通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草ANR基因完整的cDNA序列,利用生物信息学方法和工具对日本蛇根草ANR基因的功能结构域、生理和化学参数、亲/疏水性、信号肽、二级结构等进行预测和分析。结果表明,该基因cDNA全长为1 020 bp,编码339个氨基酸,预测其蛋白分子量为36.37 kD,等电点为5.92,为亲水蛋白,不含信号肽序列。综上,本研究成功克隆获得日本蛇根草ANR基因并完成其生物信息学分析,研究结果将为解析该基因的功能奠定基础。     

日本蛇根草无色花青素双加氧酶基因的克隆及其序列分析

无色花青素双加氧酶(LDOX)是花青素合成途径末端的一个关键酶,在该酶的催化作用下,能将无色花色素转变为有色花色素。本研究采用RT-PCR方法成功克隆出日本蛇根草LDOX基因的cDNA序列后,并对其进行了生物信息学分析。分析结果显示,日本蛇根草LDOX基因的cDNA全长为1 041 bp,编码346个氨基酸,理论等电点为5.50,预测其蛋白分子量为38.63 k D,LDOX蛋白为不稳定蛋白,不存在信号肽,很可能定位在细胞质中。二级结构分析显示,其无规则卷曲的含量最高,与三级结构预测结果相符合。日本蛇根草LDOX基因的克隆与生物信息学分析对于进一步研究该类酶的结构和功能以及植物花青素的生物合成具有重要意义。     

茶树黄酮醇合成酶基因的克隆与原核表达

本研究采用EST测序技术和RT-PCR技术,获得了一个茶树茶多酚代谢中的重要基因--黄酮醇合成酶(FLS)基因,在GenBank登录(GenBank accessionNo.EF205150),其序列全长1317 bp,其中开放阅读框长996bp,编码331个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号,推测的蛋白分子量约为37.5kD,理论等电点为5.80.序列分析表明它与葡萄FLS基因序列的亲缘关系比较近.将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IFTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明茶树黄酮醇合成酶基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符.用Ni-NTA亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,得到了纯度在90%以上的纯化蛋白,为进一步研究PET-FLS融合蛋白的活性及功能奠定了基础.     

基于转录组测序的羽衣甘蓝叶色相关基因分析

叶色是羽衣甘蓝重要的观赏性状之一。本研究采用Illumina Hi-Seq2500高通量测序技术,对基因型纯合的紫叶和白叶羽衣甘蓝叶片进行转录组测序,筛选差异基因并与GO和KEGG数据库比对进行注释分析,分析羽衣甘蓝叶色形成相关基因。结果显示,获得高质量短读序共104 608 770条,筛选出紫叶相对白叶的差异表达基因1 993个,其中上调表达基因1 094个,下调表达基因899个。根据GO功能分类可分为生物过程、细胞组分和分子功能3大类64功能组。根据KEGG代谢通路分析可以分为171类,在叶色相关的类黄酮生物合成途径中黄酮醇合成酶(FLS)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)上调以及类胡萝卜素生物合成途径中的类胡萝卜素β-环化酶上调与紫叶形成关系密切。本研究丰富了羽衣甘蓝的转录组信息,获得了一些差异表达基因,为进一步研究羽衣甘蓝叶色形成的遗传机制提供了有价值的信息。     

FtMYB1转录因子调控苦荞毛状根黄酮醇合成的机理研究

R2R3-MYB转录因子在植物类黄酮合成中起重要的调控作用。本研究从川荞1号中克隆获得一个R2R3-MYB家族基因FtMYB1,酵母转录激活分析显示其具有转录激活活性,激素处理下的表达模式分析显示,FtMYB1基因能够被茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导表达。在苦荞毛状根中过表达FtMYB1基因,结果表明转基因毛状根株系中总黄酮和芦丁含量显著低于野生型,且在黄酮醇合成途径下游分别编码黄酮醇合酶(FLS)和鼠李糖基转移酶(RT)的FLS和RT1基因表达量在转基因株系中显著降低,表明FtMYB1可能通过调控FLS和RT1的表达来抑制黄酮醇的生物合成。     

红花檵木LcFLS1基因的克隆及其表达与转化研究

该研究以红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)为材料,根据转录组测序结果和PCR方法克隆到1个黄酮醇合成酶(FLS)同源基因,命名为LcFLS1。生物信息学分析显示,LcFLS1的开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸。氨基酸序列分析显示,LcFLS1具有典型的2-酮戊二酸和铁依赖性双加氧酶结构域;蛋白结构预测表明,球形蛋白结构的核心区域存在10个与2-酮戊二酸配体互作的位点。进化树分析结果表明,LcFLS1与茶树(Camellia sinensis)等木本植物的亲缘关系较近,而与拟南芥(Arabidopsis thaliana)等草本植物的亲缘关系较远。荧光定量PCR检测显示,LcFLS1在红花檵木的花中相对表达量最高,而在茎中最少。成功构建了LcFLS1基因的过表达载体pLcFLS1-SUPER1300,经农杆菌侵染花序法将pLcFLS1-SUPER1300质粒转入拟南芥中获得转基因植株,PCR鉴定表明获得了转LcFLS1基因拟南芥阳性植株。该研究结果为红花檵木黄酮醇的生物合成机制研究,以及药用价值的开发利用奠定了基础。     

葡萄风信子MaFLS基因克隆与表达分析

该研究利用PCR技术从葡萄风信子‘亚美尼亚’中克隆了1个黄酮醇合成酶(FLS)基因,命名为MaFLS。MaFLS的cDNA全长为1 076bp,开放阅读框为999bp,编码332个氨基酸,推测的蛋白质分子量38.51kD,理论等电点为5.09。同源比对和系统进化分析表明,MaFLS基因编码的氨基酸具有黄酮醇合成酶典型的2-ODD超家族保守结构域,与拟南芥和高粱FLS一致性分别为60%和83%。半定量PCR和荧光实时定量PCR表达分析表明,MaFLS在花器官中高表达,在根、茎、叶中微量表达,在完全未着色的花蕾期开始表达并于花完全开放未着色时期到达峰值,之后随花发育表达量逐渐降低。原核表达检测到1条大约38kD的外源蛋白,与预测的蛋白分子量相符。该研究结果为进一步探讨葡萄风信子MaFLS基因对黄酮类物质合成的调控作用奠定了基础。     

基于丹参基因组的迷迭香酸合成酶的生物信息学分析

丹参是我国常用大宗中药材,丹酚酸B是其水溶性药效成分的代表,迷迭香酸是丹酚酸B等复杂活性物质的核心结构单元,迷迭香酸合成酶承担着催化迷迭香酸生物合成的重要作用。因此,解析丹参迷迭香酸合成酶的生物学功能,对研究迷迭香酸和丹酚酸B生物合成,促进丹参品质改善具有重要作用。本研究利用生物信息学方法,从丹参基因组库中寻找到11条迷迭香酸合成酶编码基因,并对其进行了生物信息学分析。丹参迷迭香酸合成酶属于BAHD酰基转移酶家族,分子量在36 kD至59 kD之间,多为酸性稳定蛋白,不含信号肽和导肽,无规则卷曲和α-螺旋是其二级结构的主要特征。本研究对丹参迷迭香酸合成酶进行了详细的生物信息学分析,可为今后深入研究该酶的结构特征和功能提供参考。     

罗汉果查尔酮合成酶基因的生物信息学分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是类黄酮生物合成的关键酶,在植物发育、防止UV损伤、抗病和逆境反应中起着重要作用。本研究通过EST测序,获得了罗汉果查尔酮合成酶基因序列(登录号:GU980155)。为了进一步了解罗汉果查尔酮合成酶基因的特征,我们将其与46种植物的查尔酮合成酶基因的核酸序列和氨基酸序列进行比对和进化分析。结果表明,罗汉果查尔酮合成酶基因的核酸序列和氨基酸序列与其它物种的查尔酮合成酶基因均具较高同源性,编码区相似性约为94%。使用PHYLIP和MEGA4分别构建了邻接树、最大似然树和最大简约树,但经bootstrap检验,最优树未能明确罗汉果查尔酮合成酶基因的系统发育地位。以紫花苜蓿查尔酮合成酶的三维结构为参考,利用同源建模的方法预测了罗汉果查尔酮合成酶的三维结构,发现罗汉果查尔酮合成酶具有保守的活性位点和空间结构。     

日本蛇根草DFR3基因的克隆分析及其编码蛋白的分离纯化

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)作为花色苷代谢途径下游的关键酶,对植物花色苷的合成具有重要调控作用。该研究以日本蛇根草(Ophiorrhiza japonica)为材料,采用RT-PCR方法克隆获得一个DFR基因(OjDFR3),利用生物信息学方法对OjDFR3蛋白的性质进行了分析,通过实验完成该基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的制备与纯化,为深入揭示日本蛇根草DFR基因的功能以及花色苷的合成与调控研究奠定基础。结果表明:(1)成功克隆获得一个DFR基因(OjDFR3);序列分析显示,OjDFR3基因cDNA全长为1 071 bp,可编码356个氨基酸,蛋白分子量为39.52 kD。(2)生物信息学分析表明,OjDFR3基因编码形成的蛋白由20种氨基酸组成,其中亮氨酸含量最多,不存在信号肽,是一种亲水性蛋白,定位在细胞质的可能性最大,三级结构由α螺旋、延伸链、无规则卷曲组成。(3)原核表达分析显示,重组质粒pET32a-OjDFR3可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,其最佳诱导表达条件为37℃、4 h、IPTG浓度为0.8 mmol/L,同时在100和200 mmol/L咪唑洗脱下的蛋白纯度最好。(4)按照上述最佳条件,制备并获得了大量浓度和纯度较好的蛋白。     

彩叶桂(Osmanthus fragrans)品种‘虔南桂妃’叶片红色消退过程中的转录组分析

彩叶桂(Qsmanthus fragrans)叶片发育不同时期色泽变化具有显著差异,但目前对于其内在的分子调控机制尚不清楚。本研究利用彩叶桂品种‘虔南桂妃’红色(R)、黄绿色(YG)和绿色(G)叶片进行高通量测序,以期在转录组水平上解析叶色变化的潜在原因。通过系统分析转录组数据,共得到36.66 Gb的碱基数据,检测出32 252个新转录本。在R-vs-G、R-vs-YG和YG-vs-G比较组中共筛选到23 954个差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),其中包含57类共3 308个转录因子家族成员,且下调表达的差异基因数目大于上调表达的基因数目。KEGG和GO功能分析表明,差异表达基因主要与“催化活性”、“细胞”和“代谢”等生物学功能相关。此外,筛选到了6个类黄酮生物合成途径上显著差异表达的基因,分别编码查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)、UDP-糖基转移酶(UGT)、黄酮醇合成酶(FLS)和花青素合成酶(ANS)。与红色叶片相比,这些基因的表达量在黄绿色和绿色叶片中显著降低。推测下调表达的...     

金银花黄酮醇合成酶基因全长克隆及其序列分析

根据已知的其它物种黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从金银花叶片中扩增获得黄酮醇合成酶基因部分eDNA序列,再用RACE技术获得其两端序列.序列拼接得到完整的1 248bp的黄酮醇合成酶基因,根据获得的序列,设计引物扩增获得1 001 bp的开放阅读框,编码333个氨基酸.序列分析显示,金银花黄酮醇合成酶与烟草、马铃薯和桔梗的同源性分别为86％、83％和80％,与其它物种的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性.     

烟草黄酮醇合成酶基因的克隆及其序列分析

根据已知的黄酮醇合成酶cDNA保守序列设计引物,用RT-PCR技术从烟草叶片中扩增获得黄酮醇合成酶cDNA片段,再用RACE方法得到其两端序列。根据获得的序列,设计引物分离得到完整的1188bp的黄酮醇合成酶基因,其开放阅读框编码346个氨基酸。序列分析显示,烟草黄酮醇合成酶与高杯花、矮牵牛和马铃薯的同源性分别为87％、86％和84％,与其它物种中的同源性也在80％左右,表明不同物种中黄酮醇合成酶基因具有高度同源性。此外,在氨基酸水平上,该酶与其它依赖于2-酮戊二酸的双加氧酶及其相关酶也具有同源性。     

基于转录组测序的油菜花粉BpFLS基因克隆与分析

【目的】青海门源油菜耐寒冷、抗性强,其花粉积累了丰富的类黄酮物质,该研究可为提高黄酮醇含量的基因工程育种提供参考依据。【方法】研究采用转录组测序技术从青海门源油菜花粉和河南郑州油菜花粉筛选差异表达的黄酮醇合成酶基因,并对BpFLS基因进行生物信息学分析和RACE-PCR克隆。【结果】(1)筛选出6个差异表达的油菜花粉黄酮醇合成酶基因,BpFLS1-1基因在青海门源油菜花粉中差异最大且表达上调。(2)BpFLS1-1基因编码的氨基酸序列具有黄酮醇合成酶活性和黄烷酮-3-羟化酶活性。(3)BpFLS1-1基因可能含有新的蛋白质编码区序列,其长度为1 170 bp。【结论】BpFLS1-1基因在门源油菜花粉积累丰富的类黄酮物质及油菜抗逆性方面发挥重要功能。     

八氢番茄红素合成酶(PSY)的生物信息学分析

目的:通过生物信息学方法对八氢番茄红素合成酶基因(PSY)及氨基酸序列分析,并构建三维结构。方法:运用生物信息学方法对八氢番茄红素合成酶基因及其蛋白质序列的理化性质、亲/疏水性、信号肽、跨膜结构域、糖基化位点,磷酸化位点,二级结构,功能结构域和三级结构进行预测分析。结果:PSY基因含1239bp的开放阅读框,编码氨基酸数为412,为碱性不稳定蛋白;八氢番茄红素合成酶富含Arg、Leu、Ala、Ser、Val等氨基酸,为亲水性蛋白质;PSY为非跨膜蛋白,不含信号肽,具有多个磷酸化位点,α螺旋和无规卷曲是其主要结构元件。结论:用同源建模的方法构建其三维结构,得到合理模型,为采用生物工程提高番茄红素产量提供理论依据。     

人参皂苷合成关键元件HMGR基因生物信息学分析

[目的]对人参皂苷生物合成途径关键元件HMGR基因进行生物信息学分析。[方法]采用生物信息学方法对人参HMGR基因编码蛋白的理化性质、结构、功能及亲缘关系进行系统分析。[结果]Pg HMGR基因序列有53个限制性酶切位点,编码573个氨基酸残基,蛋白亲水性趋势较平稳,疏水性较差;三维结构与人类其中的一个HMGR基因编码的蛋白具有54.92%的相似空间结构;推测HMGR基因可能在生物学、细胞及分子功能方面发挥重要作用;与三七HMGR基因序列同源性最高,相似性达92.49%。[结论]通过对HMGR基因功能及蛋白结构预测,明确了HMGR基因与人参皂苷生物合成密切相关,为人参皂苷HMGR基因的生物学功能研究奠定基础。     

植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成

纤维素地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源,1996年克隆了第一个植物纤维素合成酶基因,植物纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶与其他相关酶如Korrigan纤维素酶,蔗糖合成酶等来共同完成。本文介绍了植物纤维素合成酶基因和纤维素的生物合成途径及其相关基因如蔗糖合成酶基因、KORRIG-AN基因等研究进展。     

烟草FLS基因表达抑制对类黄酮代谢的影响

高等植物中黄酮醇合成酶催化二氢黄酮醇转化生成黄酮醇,是类黄酮代谢途径的关键酶之一。本研究在烟草基因组数据库中搜索获得两个类黄酮合成酶基因,即NtFLS1和NtFLS2,二者表达模式一致,均在叶片中高水平表达。在NtFLS2基因过表达载体的转化株中获得一个共抑制株系KD36,荧光定量PCR分析表明NtFLS1和NtFLS2基因表达水平均被显著抑制,类黄酮途径其它结构基因的表达水平未发生显著变化。KD36株系中二氢槲皮素含量显著上升,是对照的12倍,槲皮素、山奈酚、二氢山奈酚含量未发生显著变化。KD36株系花色更红,花青素含量是对照植株2.4倍。上述研究揭示了烟草黄酮醇合成酶基因的功能,为进一步研究烟草类黄酮代谢提供了一定的理论依据。     

贝母中环阿屯醇合成酶的生物信息学分析

目的:采用多种生物信息学手段,分析预测贝母中环阿屯醇合成酶的特征信息。方法:以浙贝母的环阿屯醇合成酶氨基酸序列为研究对象,利用Prot Param、Signal P、PSORT、Prot Scale、SOMPA、Predict Protein、PROSITE、COILS和SWISS-MODEL等在线预测工具,对其理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、二级结构、三级结构等进行分析。结果:该酶由756个氨基酸残基构成,是一种无信号肽、无跨膜结构、定位于微体的可溶性亲水蛋白。α螺旋和无规则卷曲为主要的二级结构元件。三级结构以羊毛甾醇合成酶为模板建模,功能位点是萜类合酶位点,位于603~617 aa;结合配体为Zn~(2+),结合位点为676His、677Ala、678Val、679Asn、682Trp和723Ala。结论:生物信息学手段分析预测结果可靠性较高,为进一步研究贝母活性生物碱的生物合成调控机制奠定了理论基础。     

金花茶FLS基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用RT-PCR和RACE技术,从我国珍稀濒危植物金花茶花瓣中获得了黄酮醇合成酶（Flavonol synthase,FLS）基因的cDNA全长,命名为CnFLS,GenBank登录号JF343560.1。根据该基因序列设计全长扩增引物P3/P4进行PCR扩增,将扩增产物插入PMD18-T载体并转化克隆菌株DH5α,提取质粒DNA酶切鉴定,通过酶切连接的方法将该基因与改造后的pCAMBIA1300表达载体连接,成功构建了该基因的正义表达载体pCAM-CnFLS。根据该基因的保守序列设计了含有酶切位点的特异引物G1/G2,扩增出250 bp的干扰片段并将其克隆到PMD18-T载体,在中间载体pUCCRNAi及表达载体pCAMBIA1300的基础上,通过多次酶切连接,成功构建了金花茶FLS基因的干扰表达载体pCAMRNAi-CnFLS。金花茶正义及干扰植物表达载体的成功构建,为进一步研究该基因的功能及其对花色的调控效应奠定了基础。