墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)RACK基因的克隆与表达分析

RACK基因作为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基中的部分基因,主要编码一种神经肽信号分子,在膜结合受体和细胞内效应器之间起信号传递作用。为了研究RACK基因在墨吉明对虾各个组织和发育周期中的表达,本实验通过基因克隆技术获得墨吉明对虾RACK基因ORF序列,共957 bp,编码318个氨基酸,并通过荧光定量PCR技术检测RACK基因在墨吉明对虾不同组织的表达量变化。数据分析表明,RACK基因在墨吉明对虾各个部位都有表达,其中在眼柄表达量最高,在胸节神经和血液中表达量次之,在肌肉表达量最低(p0.05)。RACK基因在墨吉明对虾整个生长周期中都有表达,且存在显著差异,总体来看糠虾时期的RACK基因表达量明显高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(p0.05)。本研究为更加深入研究RACK基因的功能与表达分析提供理论基础。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)盐度调控相关基因CLCA1的克隆及表达分析

钙激活氯离子通道调节剂(calcium-activated chloride channel regulator,CLCA)为一类金属蛋白酶依赖家族,在哺乳动物上皮组织杯状细胞的粘液产生和粘液平衡中起重要作用.为了探究CLCA1基因在凡纳滨对虾渗透压中的作用机制,本研究采用RACE技术在凡纳滨对虾中克隆出了CLCA1基因,该基因总长度为3129 bp,5'端非编码区长度为175 bp,3'端非编码区长度为107 bp,开放阅读框ORF长度为2847 bp,共编码984个氨基酸,有1个跨膜区域,膜外有VMA结构域.与其他物种氨基酸序列比对结果显示,凡纳滨对虾CLCA1氨基酸与其他物种相似性都较低,相似度最高的为刀额新对虾(Procambarus clarkii) CLCA2氨基酸序列,为47.83％.RT-qPCR结果显示,CLCA1基因在凡纳滨对虾各组织中均有表达,其中肠道、肝胰腺和鳃中的表达量较高;对不同盐度下凡纳滨对虾4个组织中CLCA1基因的定量结果显示,随着盐度的下降,CLCA1基因的表达量在4个组织中呈下调趋势,表明CLCA1基因与凡纳滨对虾的渗透压调节相关.本研究初步阐明了CLCA1基因的理化性质,对CLCA1基因在凡纳滨对虾体内各组织和不同盐度下各组织的表达定量可为CLCA1基因在今后甲壳动物的渗透压调节及免疫调节的研究提供基础支持.     

萝卜-芥蓝异源四倍体植物SR30基因转录本的选择性剪接分析

为了解异源多倍体形成后,其剪接因子基因SR30在各组织器官间的表达量以及选择性剪接模式与亲本的差异,选取萝卜-芥蓝异源四倍体(Raphanobrassica)及其亲本萝卜(Raphanus sativus)、芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)为材料,运用RACE-PCR方法克隆到全长的编码序列(CDS)和3非编码区(3 UTR),运用q RT-PCR和半定量RT-PCR检测其在各组织器官中的表达量和各转录本表达量间的差异。结果表明,四倍体中萝卜同源的Rs SR30基因有5种转录本,芥蓝同源的Bo SR30基因有4种转录本。同时,SR30在3物种中的表达具有组织器官的差异,且在四倍体中的总体表达量显著低于亲本。根据克隆到的转录本,预测Rs SR30编码3种蛋白,Bo SR30编码2种,不同蛋白异构体的区别体现在C末端的丝氨酸-精氨酸富集(RS)结构域。因此,萝卜-芥蓝异源多倍体形成后,SR30基因在表达量和转录本选择性剪接方面都发生了改变。     

贵州从江香猪FoxO4、PRKAA1基因在不同组织中的表达分析

为研究FoxO4、PRKAA1基因在从江香猪不同组织中的表达情况,本实验采用实时荧光定量PCR技术,检测FoxO4、PRKAA1基因的mRNA表达量,分析FoxO4、PRKAA1在贵州从江香猪不同组织的差异表达。结果显示,FoxO4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中均有表达,其中在脂肪组织中表达量最高,且差异极显著(p0.01),在背最长肌组织中表达量最低;PRKAA1基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中也均有表达,其中在肺组织中表达量最高,且差异极显著(p0.01),在脂肪组织中表达量次之,在背最长肌组织中表达量最低。FoxO4、PRKAA1基因可能在肌内脂肪(IMF)沉积中发挥重要作用,为进一步研究FoxO4、PRKAA1的功能奠定基础。     

贵州地方山羊不同组织GnRHR mRNA表达水平研究

[目的]了解GnRHR基因的功能,为山羊选种选育提供更好的科学依据。[方法]采用荧光定量PCR技术分析了贵州地方山羊不同组织GnRHR基因的表达差异。[结果]黔北麻羊中子宫、下丘脑、输卵管和卵巢组织的表达量分别是是垂体组织的0.31、0.42、0.01和0.03倍。贵州白山羊和小香羊垂体组织中表达量是输卵管和卵巢组织的0.13和0.01倍;GnRHR基因在贵州黑山羊下丘脑组织中的表达量是垂体组织的5.5倍,且远高于其它组织。[结论]该研究结果将会为进一步研究该基因对山羊繁殖相关功能影响的研究奠定基础。     

斑节对虾α-淀粉酶基因的克隆及其表达分析

为了研究斑节对虾α-淀粉酶基因的结构和生物学功能, 根据原实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon) cDNA文库得到的EST序列, 利用RACE技术获得了斑节对虾α-淀粉酶基因(PmAmy)的cDNA全长序列。该基因序列全长2465 bp, 包括2175 bp的开放阅读框, 编码724个氨基酸, 分子总量为78.9 kD, 理论等电点为4.66。PmAmy包含一个α-淀粉酶家族保守的A结构域(Thr34-Ser410)和一个C结构域(Glu420-Ala496)。PmAmy氨基酸序列与其他物种的相似性为47%—99%, 利用PmAmy构建的进化树显示斑节对虾和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的亲缘关系最近。基因表达结果显示PmAmy在肝胰腺组织中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。斑节对虾PmAmy基因在卵巢发育的过程中均有表达, 表达量有所变化, 虽然没有发现显著性的差异(P=0.09)。斑节对虾PmAmy在整个生长阶段的检测中都有表达, 其中幼体发育过程中存在显著性差异, 糠虾时期PmAmy表达量显著高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(P<0.05)。以上实验结果初步说明了PmAmy可能与斑节对虾的幼体发育相关。     

低温对鲤鱼的5个基因在不同组织中表达量的影响

本研究应用实时荧光定量 PCR技术对抑制性消减杂交所得到的鲤鱼不同温度下差异表达的5个基因做进一步的研究.结果表明: 水温由16℃降至4℃(骤降点)的过程中,在鲤鱼的肝、肠组织中,LKE-25基因的表达量呈下降趋势,而LKE-62基因则呈上升趋势;在肾脏组织中,LKE-48-1、 LKE-48-2和LKE-59基因的表达量呈上升趋势,且随着4℃维持时间的延长,其表达量逐渐下降.LKE-25和LKE-59基因在4℃同一尾鱼的心脏、脑、肝、脾、肾、肠组织中的表达量上有很大差异,其中LKE-25基因在心、LKE-59基因在肾组织中的表达量最高 .本实验所研究的5个基因在不同温度、不同组织表达量的显著差异,证明了这些基因与水温相关且有组织特异性 [动物学报 54(3):460-466,2008].     

克氏原螯虾一种新型甲壳素基因的鉴定和抑菌功能研究

抗菌肽是无脊椎动物非特异性免疫系统中重要的免疫因子,抗菌肽具有良好且广谱的抗菌活性,并且不易产生耐药性,有望替代传统抗生素药物发挥功能.甲壳素(Crustin)是目前甲壳类动物中研究比较广泛的一类抗菌肽家族.研究鉴定了来自克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中的一种新型Crustin基因,命名为Pc-C...     

凡纳滨对虾细胞色素P450(CYP370C2)基因的克隆与表达分析

细胞色素P450(CYP)酶系在机体的毒素、污染物和药物等代谢过程中发挥着重要作用,为深入了解对虾CYP基因的结构和功能,采用c DNA末端快速克隆技术得到凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei CYP家族基因CYP370C2的全长c DNA序列,共1 745 bp,包含1个1 464 bp的开放阅读框,编码487个氨基酸。CYP370C2基因序列中具有CYP蛋白特有的血红素结合区、Ⅰ螺旋保守区、C螺旋保守区和K螺旋保守区。同源性比对结果显示,凡纳滨对虾CYP370C2基因序列与三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的CYP基因相似度最高,为64%。CYP370C2基因在所有检测的组织中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高,鳃和肠道次之。在48 h的氨氮胁迫试验中,胁迫24 h后,肝胰腺和鳃中的CYP370C2基因相对表达量与对照组相比均显著上调,分别在48 h和24 h达到峰值。脂多糖(LPS)注射后,CYP370C2基因在肝胰腺中的相对表达量在3 h开始显著上升,在12 h达到最大值; CYP370C2基因在鳃中的表达在LPS注射后的3 h和6 h被显著抑制,12 h恢复至对照组水平,随后在24 h和48 h显著上调。这些实验结果显示,CYP370C2基因参与了氨氮胁迫响应和LPS刺激响应,表明CYP370C2基因可能在凡纳滨对虾抗环境胁迫和抗病原体的免疫防御过程中均发挥重要作用。     

凡纳滨对虾TCP-1-Beta基因的克隆及其与耐寒性状的相关性

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子机理,研究克隆了凡纳滨对虾耐寒相关基因TCP-1-Beta并对其与耐寒性状的关系进行了研究.根据电子克隆所得序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆得到长1691 bp的凡纳滨对虾TCP-1-Beta基因序列,其中包括1608 bp的完整开放阅读框,编码535个氨基酸残基.然后,运用荧光定量PCR对TCP-1-Beta基因进行时空表达谱的分析:组织表达谱的结果显示,该基因在凡纳滨对虾肝胰腺组织中表达量最高;不同低温处理下的表达结果显示,在28℃和15℃处理下基因表达量无显著变化,13℃开始呈上调表达,11℃时表达量升高;13℃低温处理发现该基因在24h内表达量无显著变化,但36h后表达量显著升高.采用PCR-RFLP方法对216尾凡纳滨对虾TCP-1-Beta基因进行了SNP多态性检测,并将其与耐寒性状进行了关联分析.在该基因编码区第420碱基上发现G/A突变,方差分析结果表明该位点的不同基因型与耐寒力指标CDH值相关(P＜0.05),其中GG基因型的耐寒能力比AA基因型强.     

凡纳滨对虾ANT2 基因的克隆及低温表达谱分析

为研究凡纳滨对虾适应低温的分子机理, 实验对从低温处理凡纳滨对虾抑制性消减文库中筛选出的一个360 bp EST 序列进行了研究。首先, 同源比对显示该EST 片段与其他物种的ANT2 基因高度同源, 命名为凡纳滨对虾ANT2 基因(LVANT2); 其次, 通过构建凡纳滨对虾肝胰腺全长cDNA 文库, PCR 扩增获得LVANT2 基因的全长cDNA1540 bp, 其中包括1011 bp 的完整开放阅读框, 编码336 个氨基酸残基。然后, 对基因进行了不同组织和低温处理的表达谱分析: (1)组织表达谱的结果显示, 该基因在凡纳滨对虾肌肉组织中表达量最高; (2)在不同低温处理下的表达结果显示, 该基因在15℃处理下基因表达量发生显著变化, 13℃开始呈下调表达, 11℃时表达量又升高; 13℃低温处理不同时间发现该基因在12h 内表达量发生显著变化,48h 后表达量最高。LVANT2 基因的低温诱导表达模式说明其可能在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用       

马氏珠母贝SRF基因的分子特征及组织特异性表达

血清反应因子(SRF)是一个高度保守的转录因子,在细胞增殖、细胞凋亡以及免疫反应中发挥重要作用。为了探究血清反应因子在马氏珠母贝中的生物学功能,本研究运用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到马氏珠母贝SRF基因(Pm SRF)c DNA的全长序列,并且应用实时荧光定量PCR技术对Pm SRF基因在马氏珠母贝不同组织中的表达进行检测。结果显示,Pm SRF基因序列全长1 758 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 440 bp,编码479个氨基酸,5'UTR为65 bp,3'UTR为253 bp,包含29 bp的poly A。预测其相对分子量为50 534.6 Da,理论等电点为7.71。多序列比对结果发现物种间SRF具有较高的保守性。SMART软件分析显示Pm SRF具有典型的MADS结构域。荧光定量PCR数据分析表明,Pm SRF基因在马氏珠母贝闭壳肌、肝胰腺、血细胞、外套膜、性腺、鳃六种组织中均有表达,其中在鳃中表达量最高。本研究可为进一步探究Pm SRF在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。     

夏枯草PvGGPPS基因的克隆和诱导表达分析

为探究夏枯草中GGPPS基因的生物学特性及功能,该文在夏枯草转录组测序的基础上设计特异性引物,采用逆转录PCR技术获得夏枯草中GGPPS基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析;采用qPCR法分析PvGGPPS基因在不同外源性物质诱导下在夏枯草果穗中的表达量以及该基因在夏枯草不同组织中的表达量。结果表明:PvGGPPS基因开放阅读框1 092 bp,编码363个氨基酸,理论分子量为38 815.68 D,等电点为5.69。PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域。系统进化树表明PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系。qPCR分析表明,PvGGPPS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA3处理组该基因表达量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。该研究结果为进一步研究PvGGPPS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

草莓光信号转导因子FaHY5的克隆及其表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过同源克隆法获得FaHY5 cDNA全长序列,运用生物学软件对该序列及其编码的氨基酸序列进行相关生物信息学及结构功能分析,同时采用半定量及荧光定量方法对FaHY5基因在不同组织和果实不同发育阶段的表达模式进行研究。结果表明,FaHY5全长为501 bp,Gen Bank登录号为KP984791,编码166个氨基酸。蛋白质分子量约为18.136 kD,理论等电点为10.05,C末端存在典型的bZIP保守结构域,是一个非分泌型核定位蛋白。序列比对及进化树分析,HY5在进化的过程中具有高度的保守性。表达谱分析,FaHY5在各组织中均有表达,且在花中表达量最高;而在果实发育过程中,FaHY5主要在前期积累。本研究分离鉴定了草莓中HY5(LONG HYPOCOTYL 5)转录因子并探索了其在草莓中的表达模式,为进一步研究草莓FaHY5转录因子的功能和作用机制提供理论基础。     

棉铃虫齿唇姬蜂嗅觉受体基因 CchlOrco 的克隆及组织表达谱分析

【目的】昆虫的嗅觉受体（olfactory receptors, ORs）一般以气味分子特异的ORs与共受体（ co-Receptor, Orco）通过形成异质二聚体在嗅觉感受中发挥关键作用,其中Orco由于具有序列的保守性而受到广泛的重视。本研究旨在克隆棉铃虫齿唇姬蜂 Campoletis chlorideae 的Orco基因,并对其组织表达谱进行分析。【方法】利用RT-PCR技术和转录组分析技术克隆棉铃虫齿唇姬蜂的Orco基因,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用Real-time PCR技术对该基因在该蜂成虫不同组织中的表达量进行分析。【结果】获得了棉铃虫齿唇姬蜂 Orco 的全长cDNA序列,命名为 CchlOrco（GenBank登录号：KP255444）。序列分析表明, 该基因开放阅读框全长1 437 bp,编码478个氨基酸,预测该氨基酸序列具有7个跨膜区。CchlOrco 主要在成虫触角中表达,且在雄蜂触角中的表达量最高,是雌蜂触角中表达量的8.0倍,而在其他组织中表达量极低。【结论】本研究克隆了棉铃虫齿唇姬蜂 CchlOrco 序列全长,明确了其在成虫不同组织中的表达水平,为进一步研究该基因及其他嗅觉受体基因功能奠定了基础。     

罗氏沼虾蜕皮激素受体EcR基因的克隆及表达分析

为获得罗氏沼虾蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)基因编码序列,并检测mRNA表达模式。本实验拟利用克隆测序技术,以肝胰腺为实验素材,扩增EcR基因的编码区;借助生物信息学手段对所得序列进行分析;采用实时荧光定量PCR技术检测EcR基因在肌肉和肝胰腺等8个组织中的m RNA表达量。结果表明,罗氏沼虾EcR基因的编码区长度为1 716 bp,共编码571个氨基酸。物种间同源性比较分析发现,罗氏沼虾EcR基因序列与褐虾、黑背陆地蟹、日本沼虾、美洲龙螯虾、大西洋砂招潮蟹、蓝蟹、三疣梭子蟹、中华绒螯蟹和拟穴青蟹的同源性分别为90.7%、84.1%、83%、81%、81%、80.6%、79.8%、77.2%和75.9%。组织表达谱结果显示,EcR基因在所检8种组织中广泛表达,且不同性别相同组织间和相同性别不同组织间EcR的表达均存在不同程度的差异性。其中EcR基因在雄虾的鳃组织中表达量最高,在肌肉组织表达量最低;在雌虾的卵巢组织中高表达,在腹节神经组织中低表达。此外,EcR基因在雌虾的性腺、肠和肝胰腺组织中的表达量极显著或显著高于雄虾(p0.01或p0.05),在鳃组织中极显著低于雄虾(p0.01)。本研究成功克隆了罗氏沼虾的EcR基因,检测到EcR基因在各组织中广泛表达,且在不同性别相同组织和相同性别不同组织中存在显著差异。本实验为进一步研究EcR基因与生长发育调控作用提供了理论依据。     

棉铃虫离子型受体基因HarmIR8a的克隆及表达定位

【目的】昆虫离子型受体(ionotropic receptors, IRs)是新发现的一类化学感觉受体,对昆虫感受环境中酸类和胺类等物质发挥着重要作用。基因克隆、序列比对以及表达定位的研究将有助于初步解析棉铃虫Helicoverpa armigera离子型受体的功能。【方法】本研究在棉铃虫触角转录组测序和分析的基础上,利用PCR技术克隆了一个离子型受体基因的全长序列,并进行序列结构预测等分析;利用荧光定量PCR技术对该基因在棉铃虫雌、雄成虫不同组织中的表达量进行了分析;同时利用原位杂交技术检测了该基因在棉铃虫雄虫触角中的表达定位。【结果】克隆获得棉铃虫HarmIR8a基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MH638313),开放阅读框为2 688 bp,编码895个氨基酸,预测有3个跨膜区域。HarmIR8a氨基酸序列包含了一个氨基末端区域(amino terminal domain, ATD),一个由S1和S2两部分构成的配体结合域(ligand binding domain, LBD),一个孔环(pore loop, P),3个跨膜区(M1, M2和M3)和一个胞内C末端(C terminus)。荧光定量PCR结果显示,HarmIR8a在棉铃虫雌、雄成虫头(除去附器)和触角等组织中均有表达,而且在触角中高表达。棉铃虫雄虫触角原位杂交结果表明,HarmIR8a主要在触角腔锥形感器下表达。【结论】本研究初步探析了HarmIR8a基因的转录水平和表达部位,为进一步研究棉铃虫离子型受体基因的功能和生理作用奠定了基础。     

欧洲千里光花发育相关基因SvGLOBOSA功能研究

菊科(Asteraceae)植物独特的头状花序具有重要的观赏与研究价值,其花发育分子机制复杂,目前相关报道较少。本研究对欧洲千里光(Senecio vulgaris)转录组数据进行筛选,初步得到MADS-box基因SvGLOBOSA(SvGLO),并对其功能进行了初步分析。通过生物信息学分析基因结构并预测其功能;qRT-PCR分析了SvGLO在野生型欧洲千里光不同组织中的相对表达量;在龙葵(Solanumnigrum)中过表达SvGLO并进行形态学观察;通过组织学染色分析转基因龙葵子房的组织细胞形态变化。结果表明,SvGLO的开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为591 bp,编码196个氨基酸;具有典型的MADS-box和K-box结构域且在C末端含有PI基序(motif)EPFSFRVQPMQPNLQE,属于B类MADS-box基因的PI/GLO亚家族。qRT-PCR结果表明,SvGLO在花序组织中高表达,在营养器官中不表达;同时在过表达龙葵中观察萼片获得花瓣的部分特征,心皮转化为雄蕊状器官,果实发育异常。组织学染色分析结果表明,转基因龙葵的子房壁细胞形态...     

山羊CAST基因Ⅱ型转录本的克隆及在山羊不同组织中的表达

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)基因是与畜禽肉质性状密切相关的重要候选基因。文章根据牛和绵羊CAST基因mRNA,应用RACE技术首次成功克隆了山羊CAST基因Ⅱ型转录本(以下简称CASTⅡ基因)全长cDNA,对序列及编码的氨基酸进行了生物信息学分析。结果显示,该基因cDNA全长2 474 bp,完整的开放阅读框(ORF)为558~2 252 bp,编码564个氨基酸。氨基酸序列中存在4个保守结构域和1个保守七肽序列;蛋白质二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主,富含疏水区,存在多个磷酸化位点以及蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)的磷酸化位点。通过实时荧光定量RT-PCR技术分析了CASTⅡ基因在天府肉羊部分组织中的表达情况。结果表明:CASTⅡ基因在所选择的天府肉羊7种组织中均有表达,半岁各组织中,眼肌的表达量最高,与腿肌差异显著(P<0.05),极显著高于内脏各组织(P<0.01);在眼肌组织中,CASTⅡ基因的表达量随着年龄的增长而增加,3岁时的表达量最高。     

间隙连接蛋白43基因在斑马鱼和金鱼中的表达模式分析

间隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)是间隙连接蛋白家族的成员之一,在多种组织和细胞类型上广泛表达,参与体内平衡、胚胎发育、细胞分化及生长等生理活动。现以斑马鱼(Danio rerio)和金鱼(Carassius auratus)为材料,运用RT-PCR方法检测了Cx43基因在其组织和胚胎发育中的表达模式。结果显示:在斑马鱼的组织中,Cx43基因在心脏中的表达量最高,而在肾脏和卵巢的表达量较低;在不同发育时期的胚胎中,Cx43基因在体色素期和出膜期中的表达量较高,而在胚胎发育早期的表达量相对较低。在金鱼组织中,Cx43基因在心脏中的表达量较高,而在鱼鳍和眼睛的表达量较低;在不同发育时期的胚胎中,Cx43基因表达模式基本上与斑马鱼的12个时期相一致。研究表明,Cx43基因在鱼类不同组织和不同胚胎发育时期中可能行使不同的功能,但其具体的功能和机制还有待进一步研究。