两株母乳源植物乳杆菌的全基因组测序分析

【背景】母乳是一个重要的益生菌筛选库,其中植物乳杆菌是一种用途广泛、适应性强的益生菌。然而不同菌株具有不同的功能,现有的生理生化方法对其潜在益生特性研究十分有限,有必要采用高通量的方法寻找具有种群特异性的优质益生菌。【目的】结合菌株生化特征在全基因组的测序与分析的基础上对两株植物乳杆菌的潜在功能进行预测,并重点找寻与肠液耐受性及细菌素的合成相关的基因,即在基因组的结构上对菌株的表型进行探究。【方法】分离筛选出两株母乳源植物乳杆菌MP55、MP37,并利用Illumina genome analyzer对菌株的全基因组进行测序,采用Prokka软件对细菌基因组进行注释,采用Carbohydrate-active enzymes (CAZy)、Koyto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)和Clusters of orthologous genes(COG)数据库对基因组进行功能注释;同时采用Prodigal、RNAmmer等工具对编码序列、核糖体RNA进行预测,并用CGView软件绘制菌株的基因组环形图谱。【结果】通过基因组装得到了两株植物乳杆菌的全基因组信息,植物乳杆菌MP37、MP55基因组大小分别为3 204 421 bp和3 299 180 bp;(G+C)mol%含量分别为44.36%和44.46%;分别包含3 012个和3 101个DNA编码序列,结合菌株生化特征在基因组上找到4个与肠液耐受相关的基因及一段细菌素合成相关基因簇。基因组序列原始数据和拼接结果已提交至"gcMeta"平台。【结论】通过高通量测序分析在基因组水平上揭示了植物乳杆菌MP55、MP37在肠道存活性与抑制病原菌相关的可能机理。植物乳杆菌MP55、MP37是两株潜在的益生菌候选菌株,实验结果为进一步阐明其益生菌特性的功能机制提供了遗传学基础。     

利用全基因组重测序分析鹿茸重量相关基因

茸角是鹿科动物特有的器官,具有重要的生物学意义。鹿茸生长是一个复杂的生物代谢过程,其重量与遗传因素有一定关联。本研究对饲养条件基本一致的5个梅花鹿(Cervus nippon)群体进行调查,获得高产和低产梅花鹿个体共100只,利用全基因组重测序分析这些个体与鹿茸重量相关的遗传变异。结果表明,共得到94个与鹿茸重量可能相关的遗传变异,其中有2个变异位点分别定位于OAS2和ALYREF/THOC4基因的外显子区,且ALYREF/THOC4基因在鹿茸中表达量很高。功能富集分析发现,这些遗传变异与鹿茸生长发育密切相关,可作为潜在的鹿茸重量相关遗传变异。本研究首次通过全基因组重测序直接筛选与鹿茸重量相关的遗传变异,并分析关联基因的生物学功能,对揭示鹿茸生长发育和鹿茸重量差异形成的遗传机制具有重要意义。     

浙江地区鼬獾和犬源狂犬病病毒分离株全基因组测序与分析

测定浙江地区狂犬病病毒分离株(鼬獾和犬)全基因组序列,从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析,了解狂犬病病毒在浙江的流行和变异情况以及目前浙江流行株的遗传学背景,以丰富中国狂犬病病毒街毒流行株的全基因组信息。脑内接种1~2日乳鼠分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定浙江地区狂犬病病毒分离株全基因组核苷酸序列,并进行编码蛋白和序列相似性比较及种系发生分析。测序获得狂犬病病毒浙江淳安鼬獾分离株F02、F04和松阳犬分离株D01、D02全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923和11 925 nts,前导序列Leader长58nts,5个ORF为:NP(1 353 nts);PP(894 nts);MP(609 nts);GP(1 575 nts);LP(6 386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间的伪基因Ψ长423 nts;Trailer尾长70 nts。核酸BLAST及多重序列比对分析显示浙江地区4个狂犬病病毒分离株的全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征;中国毒株之间特别是浙江同种动物狂犬病病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,浙江病毒全基因组序列编码蛋白氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变;浙江病毒负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,5个编码蛋白仅表现较少的序列变化;浙江病毒与本研究选择的代表性引用街毒株或者来自街毒的减毒株的变异位点和变异类型相似,多重序列相似性的比较和种系发生分析显示所分离的狂犬病病毒浙江街毒株均属于基因1型,具有较独特的中国地域性特点,故本研究中的浙江地区分离株极有可能是自然界中固有的街毒株。     

腹泻仔猪大肠埃希菌分离株ST4214的全基因组测序分析

分析腹泻仔猪大肠埃希菌(E.coli)分离株血清型、毒力因子及耐药基因。

本课题组前期研究从腹泻仔猪粪便样本中分离到64株E.coli, 本研究取其中含有毒力因子最多的1株进行全基因组测序分析。

E.coli分离株基因组序列为5.5 Mb, 预测蛋白质编码序列数为5 743, 与已知致病菌E.coli O145的基因重合率较低, 为64.53%。经多位点序列分型分析, 确定分离株为E.coli ST4214, 血清型为O3∶H45。与病原菌O157∶H7、O145∶H28和O104∶H4的毒力基因比较表明: 4株菌共同含有的毒力基因为354个, E.coli ST4214含有64种独特的毒力基因、编码鞭毛蛋白、Ⅳ型分泌蛋白、Ⅱ型分泌蛋白、溶血素、菌毛、肠毒素、荚膜多糖相关蛋白质。耐药基因E.coli分离株含有氨基香豆素抗性基因、磺胺类耐药基因、β-内酰胺抗性基因、多粘菌素耐药基因、肽抗生素抗性基因和抗生素耐药基因外排泵等多重耐药基因。

腹泻仔猪E.coli ST4214分离株是一株新菌株, 具有较多毒力因子及耐药基因, 可能与仔猪腹泻发病相关。

     

鸽新城疫病毒BJ-C分离株基因组测序及系统发育分析

【背景】鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type Ⅰ,PPMV-1)感染引起的危害最严重的疫病之一,至今尚无有效的防控制剂。【目的】分析鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组信息及系统发育关系,为鸽新城疫的防控提供科学依据。【方法】设计首尾重叠的6对特异性引物,利用分段扩增的方法,以鸽新城疫病毒BJ-C株基因组cDNA为模板,分别扩增、测序后进行全基因组序列拼接。以NCBI数据库中发布的新城疫病毒序列为参考,针对鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组、F基因建立系统发育树。【结果】鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组全长为15192nt。基于全基因组的系统发育分析发现其与PPMV-1/BJ-01/CH株的系统发育关系最近,核苷酸相似性为99.96%,氨基酸相似性高达100%,属于同一个分支,而与LaSota疫苗株等其他新城疫毒株的亲缘关系相对较远。基于F基因序列的系统发育树分析发现BJ-C株F基因与我国的BJP2013株同属一个分支。ClassⅡ类Ⅵ亚型F基因高变区序列(47-420nt)比对结果显示,安徽株Pigeon/Anhui/2369/2012、广东株Pigeon/Guangdong/GZ288/2013、北京株BJP13、浙江株Pigeon/Zhejiang/2036/2012及比利时株PPMV-1/Belgium/11-09620/2011等与BJ-C毒株处于同一个分支,同属Ⅵb亚型。【结论】本研究获得了鸽新城疫病毒BJ-C株全基因组序列,分析了其系统发育关系,确定其属于ClassⅡ类Ⅵb型,为后续防控产品的开发提供了理论依据。     

马赛病毒上海分离株的分离和全基因组分析

马赛病毒是一种感染棘阿米巴的大型双链DNA病毒,在世界各地都有这类病毒的分离报道。本研究从上海地区环境土壤样品中分离了一株马赛病毒。该病毒可以高效地感染棘阿米巴,病毒颗粒呈典型的二十面体结构,直径大约在0.25μm,基因组为368kb。病毒基因组DNA序列分析结果表明,该病毒属马赛病毒科的A系马赛病毒,与欧洲、澳大利亚等地报道的病毒株相似度极高。通过与分离自全球不同地区的另外四株马赛病毒比较发现大部分病毒基因都处于负选择,说明马赛病毒的核心基因非常保守并且足以支持病毒在不同地区的适应性。     

一株高产脂肪酶菌株WCO-9全基因组测序及比较基因组分析

琼氏不动杆菌WCO-9是从油污污染的土壤中分离的一株高产脂肪酶菌株,所产脂肪酶具有显著优于对照同种菌株ATCC 17908的水解活性。为探究WCO-9菌株高效产酶机制,挖掘新型特异脂肪酶功能基因,采用Oxford Nanopore技术完成WCO-9菌株的全基因组测序,并对同属菌株进行比较基因组学分析。结果显示,脂肪酶产生菌WCO-9的基因组大小为3.19 Mb,GC含量38.62%,含有2 929个编码基因,其中包含11个脂肪酶编码基因(1个特异基因)和3个脂肪酶分子伴侣基因;共线性分析也说明WCO-9菌株基因组与对照菌株ATCC 17908具有显著差异。WCO-9菌株全基因组序列分析,对该菌的高效产酶机制研究及新型脂肪酶特异基因挖掘具有重要意义,为后期高产脂肪酶工程菌的创制及工业化应用提供理论基础。     

一株新的沙门菌烈性噬菌体IME-SAL1的分离、全基因组测序和比较基因组分析

目的:分离鉴定一株沙门菌的烈性噬菌体,观察其形态大小,完成全基因组测序,分析其基因组结构和进化关系,为治疗沙门菌感染提供新的策略和实验依据。方法:以沙门菌SAL95作为指示菌从医院废水中分离噬菌体,分离到的噬菌体经浓缩和纯化后采用透射电镜观察其形态大小,提取噬菌体的基因核酸并完成全基因组高通量测序,分析其全基因组的结构特征,通过比较基因组分析研究其进化关系。结果:从解放军307医院未经消毒处理的废水中分离到一株烈性沙门菌噬菌体。电镜观察显示,该噬菌体头部呈立体对称,有一不收缩的长尾。其基因组全长113 183 bp,比较基因组分析确定该噬菌体为一株新的沙门菌噬菌体,命名为IME-SAL1。结论:从医院废水中分离到一株烈性沙门菌噬菌体IME-SAL1,研究了该噬菌体的分类、基因组结构、进化关系,可为其实际应用提供参考。     

一株猪葡萄球菌的分离鉴定、生物学特性研究及全基因组测序分析

【背景】2021年6月,广东省茂名市某散养户送检了一头发病仔猪,猪身上长有脓疱,四肢关节肿大,关节内可见脓液。【目的】确定引起仔猪发病的病原菌,分析其药物敏感性,为临床用药提供指导;对分离菌株进行全基因组序列分析,挖掘其毒力因子和耐药基因,揭示该菌致病和耐药的分子机制。【方法】取关节脓液分离细菌;通过革兰氏染色、16S rRNA基因和全基因组测序分析,鉴定细菌种类;通过溶血试验、血浆凝固酶试验和生长曲线测定,确定分离菌株的溶血活性、血浆凝固酶活性和生长特性;用小鼠感染模型评估分离菌株的致病性;用纸片扩散法测定分离菌株的药物敏感性;通过全基因组序列分析挖掘分离菌株的毒力因子和耐药基因。【结果】分离菌株被鉴定为猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus);该菌不溶血,无血浆凝固酶活性,在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中于37℃、120r/min条件下生长良好;小鼠感染试验结果显示,该菌具有高致病性;药敏试验结果显示,该菌对苯唑西林、大观霉素等7种药物敏感,对青霉素G、红霉素等9种药物耐药;全基因组序列分析结果显示,该菌携带多个毒力因子和耐药基因。【结论】从发病仔猪的关节脓液中分离到一株猪葡萄球菌,可用苯唑西林、大观霉素等药物防控该菌感染;解析了该菌的基因组信息,为后续深入研究该菌致病和耐药的分子机制奠定了基础。     

点滴复膜酵母兔源分离株基因组测序及比较分析

点滴复膜酵母Cyniclomyces guttulatus是一种定殖及生长于犬、兔、豚鼠、龙猫、大鼠和小鼠等动物胃肠道内的真菌。与大多数传统酵母相比,点滴复膜酵母具有耐酸(pH 1.5-4.5)、耐高温(38-42 ℃)的独特生长特性,可在体外快速增殖。腹泻动物粪便中可见大量点滴复膜酵母,尽管没有直接证据表明感染点滴复膜酵母会引起明显病状,但其被认为是多种动物的机会性致病菌。本研究通过全基因组测序和转录组测序明确点滴复膜酵母的基因结构和注释信息,获得点滴复膜酵母的系统性基因组和转录组数据。结果显示基因组大小为29.71 Mb,包含11 307个基因,转录组大小为17.67 Mb,GC含量分别为43.02%和43.09%;mRNA、CDS、外显子和内含子的平均长度分别为1 476、1 447、1 374和540 bp;点滴复膜酵母存在517个独特的基因家族,共包括1 162个基因,该酵母的独特基因特点为后续研究奠定基础。比较分析结果表明,点滴复膜酵母的基因组大小和数量明显大于其他12种酵母,提示该酵母可能存在全基因组复制,这可能与其独特的胃肠道定殖、耐酸和耐高温生长特性密切相关。     

1株梅花鹿源狂犬病街毒株全基因组测序与分析

对1株梅花鹿源性狂犬病街毒株(DRV)进行全基因组克隆,对全长cDNA进行测序分析.RT-PCR扩增克隆覆盖全基因组9个重叠基因片段,基因组3'和5'末端采取3,-RACE和5'-RACE方法,9个重叠基因片段序列拼接得到DRV全基因组cDNA序列,共11 863个核苷酸.DRV毒株全基因组构成与其他狂犬病毒基因组构成相似,由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,在核蛋白和糖蛋白的重要抗原位点有个别氨基酸发生变异,对已完成全基因组测序的几个基因1型毒株分别进行了N、P、M、G、L基因核苷酸及氨基酸的同源性比较.与其他具有代表性的毒株进行N基因序列比较建立的系统进化树表明,DRV毒株属于基因1型,与中国人用疫苗株3aG同源性最高为94%,与分类位置未确定的北高加索毒株(WCBV)的同源性最低为71%.本研究结果可为狂犬病毒各项分子生物学研究提供理论参考.     

中国6株狂犬病病毒街毒株全基因组测序与分析

实验研究中对分离于中国的6株狂犬病病毒街毒株进行了全基因组测序,对基因组的5个结构基因(N、P、M、G和L)的核苷酸和推断的氨基酸序列以及非编码区序列进行了分析与比较,并与来自GenBank的40株毒株从全基因组水平进行了分子进化分析。所测6株中国狂犬病病毒街毒株的全基因组核苷酸序列长度介于11 907 nt(CQ92)和11 924 nt(SH06和gg4)之间,基因组结构相同,用全基因组和不同的结构基因构建的进化树拓扑结构相似,基因组3′和5′末端高度保守而且末端11个核苷酸互补配对,5个结构基因的保守性依次是NLMGP,核苷酸同源性的最小值依次分别是81.9%、81.7%、80.7%、78.3%和76.7%。     

出芽短梗霉菌株PA-2全基因组测序及分析

【背景】出芽短梗霉菌株PA-2是一株分离自青海省海东市平安区患病杨树叶片上的真菌,前期研究表明该菌株具有除草和抑菌能力,说明其在生物农药方面具有潜在的应用前景。【目的】了解菌株PA-2的基因组序列信息,挖掘其生防相关功能基因簇,为进一步研究解析该菌株生防机理及生防功能改造提供遗传背景信息。【方法】利用IlluminaHiSeq高通量测序平台对生防菌株PA-2进行全基因组测序,用生物信息学的方法对测序数据进行基因组组装、基因预测及功能注释、碳水化合物活性酶预测、次级代谢产物合成基因簇预测,利用刚果红染色等方法对水解酶活性进行衡量。【结果】菌株PA-2基因组序列全长28 932 793 bp,平均GC含量为50%,共编码10 839个基因,预测到该菌株具有4个已知的次级代谢产物合成基因簇,编码Melanin、Burnettramic Acid A、ACR-Toxin I、Abscisic Acid,该菌株能水解纤维素和果胶。【结论】有助于在基因组层面上解析菌株PA-2生防机制的内在原因,为深入了解出芽短梗霉菌次级代谢物合成途径提供参考,对菌株PA-2的下一步相关研究具有重要意义。     

卡介苗美国株全基因组测序缺口修补及序列

【目的】对卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)美国株(BCG Tice)进行基因组补缺口(补洞)工作,以得到它的基因组完整序列。【方法】首先对BCG Tice进行高通量测序,使用SOAPdenovo软件对得到的数据进行拼接。由于在高通量测序的过程中基因组某些区域测序覆盖度低,测序质量差会使测序结果经拼接后形成众多的重叠群(contig),相邻的位置关系确定的contig形成一个scaffold,contig之间未测到的区域为缺口序列(gap),在contig末端设计引物进行PCR扩增,得到连接相邻contig的PCR产物,对PCR产物进行测序。通过优化PCR引物设计策略,尝试不同的聚合酶进行聚合反应,调整PCR反应条件并结合PCR产物构建克隆测序等方法,补齐contig之间的缺口序列。【结果】完成了BCG Tice的全基因组测序,得到了它的基因组完整序列,序列已提交到美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库。【结论】BCG属于高GC含量的革兰氏阳性细菌,其基因组GC含量高达65.65%。本文以BCG Tice基因组补洞为例,对高GC含量基因组补缺口过程中遇到的问题与采取的策略给予概述,望给相关高GC含量基因组的物种全基因组测序补缺口工作提供一些借鉴。     

番木瓜环斑病毒海南分离株全基因组序列分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)的成员之一.病毒粒体呈线状,长700～900nm,直径为12.5nm.为单分体正链RNA病毒,由多种蚜虫以非持久方式传播.依寄主范围可划分为P型和W型两种.其中P型株系(PRSV-P)是制约生产的重要病原,除了给番木瓜生产带来严重危害,也会危害葫芦科作物.W型株系(PRSV-W)是危害葫芦科作物的主要病原,虽然和PRSV-P型株系血清学反应密切相关,但不侵染番木瓜.     

木本植物全基因组测序研究进展

近年来,植物全基因组测序的结果正如雨后春笋般涌现,木本植物全基因组测序也在紧锣密鼓地展开。但由于木本植物通常基因组较大,基因组结构较为复杂,在测序、测序后的组装、注释、功能分析等均存在较大的困难。在基因组测序分析的经费预算方面也存在着较大的压力。因此,有必要对这方面的研究进展及其存在问题进行分析比较,以提高林木全基因组研究方面的效率。文章在比较分析已经发展起来的3代基因测序技术(Sanger测序法、合成测序法和单分子测序法)的基础上,选择4种已经公布的木本植物(杨树、葡萄、番木瓜、苹果),从全基因组测序的研究背景、测序结果及应用的研究进展和存在问题等方面进行了述评,对未来要开展的木本植物全基因组测序前的准备工作(材料选择、遗传图谱和连锁图谱的构建、测序技术的选择),全基因组测序结果的生物信息学分析和应用进行了讨论。     

木本植物全基因组测序研究进展

近年来, 植物全基因组测序的结果正如雨后春笋般涌现, 木本植物全基因组测序也在紧锣密鼓地展开。但由于木本植物通常基因组较大, 基因组结构较为复杂, 在测序、测序后的组装、注释、功能分析等均存在较大的困难。在基因组测序分析的经费预算方面也存在着较大的压力。因此, 有必要对这方面的研究进展及其存在问题进行分析比较, 以提高林木全基因组研究方面的效率。文章在比较分析已经发展起来的3代基因测序技术(Sanger测序法、合成测序法和单分子测序法)的基础上, 选择4种已经公布的木本植物(杨树、葡萄、番木瓜、苹果), 从全基因组测序的研究背景、测序结果及应用的研究进展和存在问题等方面进行了述评, 对未来要开展的木本植物全基因组测序前的准备工作(材料选择、遗传图谱和连锁图谱的构建、测序技术的选择), 全基因组测序结果的生物信息学分析和应用进行了讨论。     

微生物全基因组测序研究进展

本文综述了近年来大规模微生物基因组核酸序列测定的最新研究进展,介绍微生物全基因组测序的基本方法、序列的收集组装,序列缺口的填补,以及序列资料的计算机分析整理。大规模基因组测序完成后,未来面临的更大挑战是在ＤＮＡ序列基础上认识微生物的完整生物学功能。为此本文也介绍了有关基因功能分析的新技术,并对微生物基因组功能分析的未来发展作了展望。