微孔板杂交法测定椰毒假单胞酵米面亚种的DNA-DNA同源性

采用一种新的DNADNA杂交方法—微孔板法对椰毒假单胞菌酵米面亚种及伯克霍尔德氏菌属中11个种的DNADNA同源性进行测定。结果发现椰毒假单胞菌酵米面亚种与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及椰毒伯克霍尔德氏菌的DNADNA同源性均大于75%,建议这3个种应合并为同一个种,命名为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)。     

微孔板杂交法测定郴毒假单胞酵米面亚种的ＤＮＡ—ＤＮＡ同源性

采用一种新的ＤＮＡ－ＤＮＡ发校方法－微孔板法对郴毒假单胞菌酵米面亚种及伯克霍尔德氏菌属中１１个的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性进行测定。结果发现郴毒假单胞菌酵米面亚种与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及椰毒伯克霍尔德氏菌的ＤＮＡ－ＤＮＡ同源性均大于７５％,建议这３个种应合并为同一个种,命名为唐菖蒲的伯克霍尔德氏菌（Brukholderia gladioli)。     

铜绿假单胞菌环介导等温扩增技术检测方法在实验小鼠微生物控制中的应用

目的建立铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa环介导等温扩增技术(LAMP)检测方法并初步应用于实验小鼠微生物控制。方法根据铜绿假单胞菌oprL基因设计LAMP特异性引物,优化反应条件,确立LAMP的检测体系;再通过对小鼠血清样本的检测,与《GB/T 14926. 17-2001实验动物绿脓杆菌检测方法》对比,阳性结果再用PCR方法验证。结果新建立的LAMP方法特异性强,灵敏度比普通PCR高10~3倍;当反应温度为66℃,内引物和环引物的浓度分别为70μmol·L^-1和30μmol·L^-1时,LAMP反应体系最佳;利用建立的LAMP方法检测87份小鼠血清样本,铜绿假单胞菌检出率为11. 5%(10/87),比《GB/T 14926. 17-2001实验动物绿脓杆菌检测方法》的高(0/87),阳性结果与PCR方法一致。结论本研究建立的LAMP方法特异性强、灵敏度高、可重复率高、稳定性好,为检测铜绿假单胞菌提供了新的研究手段。     

Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans中文名称的使用现状分析与思考

Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans是一种可引起人类食物中毒的致病菌,该菌产生的米酵菌酸等毒素通过作用于线粒体而造成机体损伤,机体中毒后死亡率高于30%,并且尚无特效药。B. gladioli pv. cocovenenans的分类学历史颇为曲折,从描述到被正式命名经历了漫长的过程,随着相关研究的增加及深入,出现了多个不同的中文名称,目前仍然存在不同的表述。这不仅阻碍了研究的开展,也会影响医护治疗成本,甚至延误病患的抢救时机。本文梳理了B. gladioli pv. cocovenenans的生物分类学历史,对其中文名称的使用现状进行了分析,并认为“唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种”可能是更为合适的译名。同时也对另外3类致病变种的中文名称做出展望。     

牡蛎单孢子虫环介导等温扩增可视化检测方法的建立

目的:建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的单孢子虫可视化检测方法。方法:根据尼氏单孢子虫的小亚基核糖体RNA保守序列,设计一套特异性LAMP引物,对反应条件如温度和试剂浓度进行优化,建立检测牡蛎单孢子虫的LAMP方法。结果:所建立的方法的敏感性可达1 fg,是常规PCR方法的100倍;全部反应可在1 h内完成;可通过肉眼观察颜色,直接判定结果;对其他牡蛎常见病原体的检测结果均为阴性。结论:建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于牡蛎单孢子虫感染的快速检测。     

环介导等温扩增技术在食品中痢疾志贺氏菌快速检测

【目的】探讨、优化基于环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的方法。【方法】在NCBI数据库中搜索获取志贺氏菌的特异性基因高度保守区,设计3对LAMP反应引物,建立、优化该LAMP可视化检测方法,并评价其特异性、灵敏度,同时与PCR检测方法和传统检测方法对比,进行结果统计分析。【结果】5株志贺氏菌标准菌株样品均检测为阳性,11株非志贺氏菌标准菌株样品均检测为阴性,无交叉反应。最低检验限为1.6×101 CFU/反应(或1.6×101 CFU/m L),且经比较,LAMP检测灵敏度比PCR检测高出1个数量级。通过对161份实际样品和人工污染样品进行检测,LAMP检测与传统方法检测结果具有较高的一致性。【结论】LAMP具有检测过程快速简便、检测结果稳定、可靠的特点,适用于对常规食品中感染性痢疾志贺氏菌的高效、快速检测需求。     

污染食品中米酵菌酸的分布、毒性机制及检测方法研究进展

米酵菌酸是一种由椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans)产生的剧毒生物毒素,通常污染鲜湿米粉、发酵米面制品、木耳和银耳等,严重威胁人类健康。然而,目前尚无米酵菌酸早期干预和解毒的方法,了解米酵菌酸的污染分布规律、毒性作用机制和快速检测技术等相关信息尤为重要。本文综述了食品中米酵菌酸的污染分布、毒性作用机制、检测标准和技术,展望了米酵菌酸检测、控制和解毒方面的研究趋势,为防控米酵菌酸污染及开发特效解毒剂提供了重要参考。     

水霉菌环介导等温扩增检测方法的建立

【目的】建立一种快速简单检测水霉病病原菌的方法。【方法】针对水霉菌ITS区基因序列设计4条特异性引物,包括两条外引物和两条内引物,优化反应条件,观察检测结果。对该方法的特异性和敏感性进行研究。【结果】建立了环介导等温扩增技术检测水霉菌的方法,确定了其最适反应条件。该方法能够检测到浓度低至103个/mL的水霉菌孢子,其灵敏度是普通PCR方法的100倍。【结论】建立的检测水霉菌的LAMP技术,具有操作简便快速等特点,可用做特异性水霉及其孢子的快速鉴定。     

环介导等温可视扩增检测牛分枝杆菌方法的建立

目的:建立一种快速简便检测牛分枝杆菌的方法。方法:根据已发表的牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成6对特异扩增牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,通过条件优化,建立针对牛分枝杆菌的环介导等温扩增(LAMP)检测法,测定其特异性和敏感性,并对采集的牛临床样品的DNA分别进行检测。结果:采用该法只检出牛分枝杆菌,检测的最低拷贝数为1×102拷贝/μL。结论:建立的LAMP方法简便、快速、特异性高,可用于临床上牛分枝杆菌的快速检测。     

新疆外来入侵杂草豚草属LAMP快速检测技术的建立

【目的】开发外来入侵生物三裂叶豚草和豚草不同生育期、不同部位的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以达到田间快速、准确和高效识别的目的。【方法】以SYBR Green Ⅰ为指示剂,分别针对三裂叶豚草和豚草不同发育阶段(幼苗期、生长期、种子期)开展LAMP技术开发。【结果】特异性验证结果显示,所检测杂草的LAMP产物均呈阳性(产生白色沉淀),而与其对照的其他2种杂草的LAMP产物均为阴性(无白色沉淀)。灵敏度检测结果显示,该体系的DNA最低检测限为10^-10 ng·μL^-1,比常规聚合酶链式反应灵敏度高。【结论】本研究建立的LAMP检测体系能有效应用于三裂叶豚草和豚草样本的快速检测,为其快速、高效识别提供技术支撑。     

Comparative genomics-guided loop-mediated isothermal amplification for characterization of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

Aims:  To design and evaluate a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) protocol by combining comparative genomics and bioinformatics for characterization of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (PSP), the causal agent of halo blight disease of bean ( Phaseolus vulgaris L.).
Methods and Results:  Genomic sequences of Pseudomonas syringae pathovars, P. fluorescens and P. aeruginosa were analysed using multiple sequence alignment. A pathovar-specific region encoding pathogenicity-related secondary metabolites in the PSP genome was targeted for developing a LAMP assay. The final assay targeted a polyketide synthase gene, and readily differentiated PSP strains from other Pseudomonas syringae pathovars and other Pseudomonas species, as well as other plant pathogenic bacteria, e.g. species of Pectobacterium , Erwinia and Pantoea .
Conclusion:  A LAMP assay has been developed for rapid and specific characterization and identification of PSP from other pathovars of P. syringae and other plant-associated bacteria .
Significance and Impact of the Study:  This paper describes an approach combining a bioinformatic data mining strategy and comparative genomics with the LAMP technology for characterization and identification of a plant pathogenic bacterium. The LAMP assay could serve as a rapid protocol for microbial identification and detection with significant applications in agriculture and environmental sciences.     

环介导等温基因扩增技术及其在病毒检测中的应用

环介导等温扩增是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有特异性高、敏感性高、简单、快捷及不需要昂贵的仪器设备等特点,受到了生物医学研究者的高度关注。目前,该方法已经被广泛应用于各种病原微生物检测。简要综述了环介导等温扩增技术的原理、特点,及其在病毒检测中的应用。     

一株高效解磷菌的筛选鉴定及溶磷性能

【背景】土壤中大部分磷元素是以难溶性磷酸盐的形式存在,不能被农作物有效利用,而传统化学肥料会带来环境污染等问题。【目的】解决土壤磷缺失现状,开发新型、安全、高效的微生物菌肥。【方法】取武汉科技大学图书馆后土壤为试验材料,筛选出一株高效解磷菌。通过个体形态鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析鉴定菌株,以NBRIP为基础培养基进行条件优化,借助高效液相色谱进行细菌解磷机理探究。【结果】所筛选的高效解磷菌株为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)。在20种氨基酸中,D-蛋氨酸对菌株的生长和溶磷促进作用最好,促进效果达到19.09%和16.16%,甲酸钠对菌株的生长和溶磷有抑制效果,抑制效果达到39.08%和10.66%。该菌株通过分泌葡萄糖醛酸、D-L-苹果酸等有机酸溶解环境中的磷酸盐,将菌株制作成菌肥对辣椒幼苗有明显的促生长作用。【结论】利用唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)分泌有机酸溶解土壤中的磷酸盐,可为生物肥料的制备和应用提供一定的理论参考。     

牛支原体环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条检测方法的建立

【背景】牛支原体(Mycoplasma bovis)是引起牛乳房炎、关节炎及呼吸道疾病等的重要病原体之一,严重危害养牛业的健康发展。【目的】建立一种便捷、快速、灵敏和特异的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术结合横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)方法用于牛支原体的检测。【方法】对牛支原体P48特异性基因序列进行对比,选择保守性区域。运用Primer Explorer V5在线软件设计引物,并通过荧光染料法与以oppD/F、oppD、urvC为靶基因所设计的LAMP引物进行比较。对筛选出的最佳P48引物组的内引物(FIP/BIP)用生物素和6-羧基荧光素标记;利用单一控制变量法对反应温度、时间与引物浓度比进行优化;将LAMP检测方法与LFD相结合。最后评价该方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用效果。【结果】P48 LAMP引物组荧光信号更强,C_t值较小,扩增效率较高,优于已报道的LAMP引物组;当反应温度为60 ℃、引物(F3/B3:FIP/BIP)浓度比为1:4、反应时间为40 min时最佳;最低检测浓度为17.28 fg/µL,比行业标准PCR检测方法灵敏1 000倍;与多杀性巴氏杆菌、牛疱疹病毒等9种引起牛呼吸道疾病相关病原体均无交叉反应;批间与批内试验均一致;运用该方法对39份临床鼻拭子的检出率为28.21%,高于行业标准的PCR法(检出率23.07%)。【结论】成功建立一种敏感、特异以及便于基层使用的牛支原体LAMP-LFD检测方法,为防控牛支原体病提供了技术支持。     

用于高灵敏可视化检测松材线虫的闭管等温扩增法

建立了一种基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的松材线虫高灵敏可视化闭管检测方法。针对松材线虫核糖体DNA的序列保守区域设计LAMP引物,通过优化LAMP体系中的Mg2+、甜菜碱浓度和反应温度等因素,建立了环介导等温扩增法;并结合蜡封反应管对产物进行检测,检测结果可直接通过肉眼观察SYBR Green I荧光显色进行判定。结果表明,本方法可检测到低至10拷贝/管的松材线虫核酸片段,可对单条线虫进行检测,并且具有很高的特异性,能区分检测松材线虫与拟松材线虫。由于整个反应恒温进行,无需热循环仪;闭管检测极大地降低了扩增产物交叉污染的风险;检测速度快,整个检测过程只需40 min,为松材线虫的现场快速筛检提供了一种简便、高灵敏、高特异的工具。     

The structure of a putative exopolysaccharide of Burkholderia gladioli pv. agaricicola

A putative capsular polysaccharide containing d-rhamnose was isolated from the phytopathogenic bacterium Burkholderia gladioli pv. agaricicola by phenol/water extraction followed by ultracentrifugation of the separated water phase and gel-permeation chromatography of the thus obtained supernatant. By means of chemical analyses and NMR spectroscopy, the repeating unit of the polymer was shown to be a linear tetrasaccharide with the structure.     

以agr基因为靶点快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

旨在建立一种以agr基因为靶点,快速检测金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增（LAMP)方法。针对金黄色葡萄球菌附属基因调控基因agr序列,设计了4条特异性引物;优化了LAMP体系中甜菜碱、dNTP浓度、长短引物比等因素;通过对14株不同金黄色葡萄球菌菌株和4株其他常见食品致病菌株进行检测,评估引物特异性。结果表明,在Mg²⁺浓度为2.4 mmol/L,dNTP浓度为0.8 mmol/L,甜菜碱浓度为0.1 mol/L,长短引物比为1:8,65 ℃反应50 min条件下扩增可达最佳效果。优化后的LAMP对14株金黄色葡萄球菌均表现为阳性,对4株非金黄色葡萄球菌菌株表现为阴性,证明引物具有特异性。本文首次利用agr基因作为靶基因片段,建立了一个简单、快速、特异性强的检测金黄色葡萄球菌的方法,在食品安全检测方面极具意义。