丝裂原活化蛋白激酶基因CfMKK1调控果生炭疽菌的生长发育和致病力

【目的】由果生炭疽菌引起的炭疽病是油茶的主要病害,造成油茶产量下降。本文研究果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1的生物学功能,旨在为解析油茶炭疽病菌的致病机理提供依据。【方法】根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段,采用PEG介导法将载体导入原生质体中筛选获得突变体菌株DCfmkk1;PCR扩增果生炭疽菌含有启动子的CfMKK1基因回补片段,构建回补载体pYF11::CfMKK1;采用PEG介导法把回补载体转化至突变体的原生质体中,荧光筛选回补菌株ΔCfmkk1-C。测定野生型菌株、突变体菌株DCfmkk1及基因回补菌株ΔCfmkk1-C在营养生长、附着胞形成、胁迫应答和致病力等生物学表型。【结果】与野生型和回补菌株相比,CfMKK1基因敲除突变体ΔCfmkk1菌丝生长速率明显减缓;在含刚果红的PDA培养基上菌丝生长受到明显抑制,无法穿透玻璃纸,丧失了侵染寄主的能力;而且无法形成附着胞。【结论】研究结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的生长发育、附着胞形成、致病力以及响应外界胁迫过程。     

苹果树腐烂病菌非核糖体多肽合成酶基因VmNRPS12的功能

【目的】非核糖体多肽合成酶(NRPS)在植物病原真菌与其寄主互作过程中发挥着重要作用,明确Vm NRPS12基因在苹果树腐烂病菌致病过程中的功能,将为今后深入研究苹果树腐烂病菌NRPS作用机制提供理论依据。【方法】基于苹果树腐烂病菌全基因组数据,得到VmNRPS12基因。运用qRT-PCR技术分析VmNRPS12在侵染初期的表达水平,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化获得该基因抗潮霉素的突变体,对突变体进行PCR检测及Southern blot验证得到敲除突变体,进一步通过重新导入该基因全长片段获得互补突变体,最后对野生型、敲除突变体和互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】定量分析显示该基因在侵染初期显著上调表达,且接种48 h后的表达量是对照的138.6倍。该基因的敲除突变体在营养生长及产孢方面与野生型菌株03-8相比无显著性差异,但致病力与野生型菌株03-8相比显著减弱,且互补突变体致病力近似恢复至野生型水平。【结论】VmNRPS12基因与苹果树腐烂病菌致病性相关。     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。     

果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因Cfcyp450的功能

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola能够引起苹果炭疽叶枯病和苹果苦腐病。前期通过基因组分析发现一个叶枯型C. fructicola菌株特异基因Cfcyp450。本研究对其功能进行分析,以明确其在致病中的作用。采用同源重组方法获得了敲除突变体。表型分析显示,Cfcyp450敲除突变体与野生型生长速率无明显差别,但敲除突变体菌落变白;与野生型相比,突变体附着胞形成降低30.02%;侵染钉延伸菌丝对玻璃纸的穿透率下降41.19%。致病性测定显示,突变体对嘎啦叶片致病力显著下降。生物信息学分析显示,Cfcyp450仅存在于叶枯型菌株中,同时与烟草和拟南芥内生菌同源性较高,但与刺盘孢属物种亲缘关系较远。这些结果表明果生刺盘孢Cfcyp450基因为叶枯型菌株的关键致病因子,可能通过水平转移获得。     

灰葡萄孢丝裂原活化蛋白激酶编码基因bmp1和bmp3的功能

【背景】植物病原真菌丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径参与病菌有性生殖、细胞壁完整、菌丝侵染、致病力、胁迫响应等过程,灰葡萄孢MAPK信号途径参与病菌生长发育、致病力以及胁迫响应,但MAPK信号途径基因在灰葡萄孢中的功能尚未完全阐明,该信号途径对灰葡萄孢的生长发育和致病力的调控机制尚不明确。【目的】明确灰葡萄孢MAPK编码基因bmp1、bmp3在病菌生长发育、致病力以及氧化胁迫响应过程的功能,为进一步阐明MAPK信号途径调控灰葡萄孢生长发育和致病力的分子机制奠定基础。【方法】利用RNAi技术构建灰葡萄孢MAPK编码基因bmp1和bmp3的RNAi突变体,并以野生型BC22菌株为对照,对bmp1和bmp3基因的RNAi突变体的表型、致病力以及对氧化胁迫的敏感性进行分析。【结果】灰葡萄孢bmp1和bmp3基因的RNAi突变体其菌落形态、菌丝形态均与野生型BC22菌株没有明显差别;bmp1基因的RNAi突变体生长速率明显减慢,分生孢子产量明显降低;bmp3基因的RNAi突变体的生长速率与野生型BC22菌株没有明显差别,不能产生分生孢子。bmp1和bmp3基因的RNAi突变体在番茄果实的表面均不能产生明显的致病症状,而且不能穿透玻璃纸。bmp1基因的RNAi突变体在含有H_2O_2的培养基上受抑制的程度显著低于野生型,而在含甲萘醌的培养基上受抑制的程度显著高于野生型;bmp3基因的RNAi突变体在含有H_2O_2和甲萘醌的培养基受抑制的程度均显著高于野生型。【结论】灰葡萄孢bmp1基因正调控病菌生长、分生孢子形成、致病力和穿透能力,参与调控病菌对氧化胁迫的响应;灰葡萄孢bmp3基因正调控病菌分生孢子形成、致病力、穿透能力以及对氧化胁迫的响应。     

蛋白-O-岩藻糖基转移酶1基因CfPOFUT1在果生炭疽菌中的功能分析

【目的】蛋白-O-岩藻糖基转移酶1 (protein O-fucosyltransferase 1,POFUT1)是催化蛋白质O-岩藻糖基化的关键酶,在动物和人体内被证明调控一系列的生理病理过程,然而POFUT1基因在果生炭疽菌乃至真菌中还未见报道。本研究旨在克隆果生炭疽菌中CfPOFUT1基因,并分析其生物学功能。【方法】利用RT-PCR技术扩增CfPOFUT1的基因并进行生物信息学分析,构建了CfPOFUT1基因的沉默和过表达载体,通过PEG介导法将载体导入原生质体中获得CfPOFUT1基因的沉默和过表达突变体。测定了野生型菌株、CfPOFUT1沉默菌株和过表达菌株在PDA上的菌丝生长、分生孢子产生、萌发与附着胞形成、胁迫应答和致病力、杀菌剂敏感性等生物学表型。【结果】与野生型菌株相比,基因过表达突变体产孢量显著增加,致病力增强,对嘧菌酯敏感性降低,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性增强。基因沉默突变体产孢量减少,细胞壁完整性、内质网应激敏感性提高,致病力减弱,对嘧菌酯敏感性提高,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性降低。【结论】CfPOFUT1基因参与调控果生炭疽菌分生孢子产量,细胞壁完整性、内质网对应激和药剂敏感性,并对其致病性也具有一定的影响。     

香蕉枯萎病菌中Hog1 MAPK同源基因FoHog1敲除突变体的生物学特性

【目的】研究香蕉枯萎病菌4号生理小种中促分裂原活化蛋白激酶基因FoHog1的结构特点及其功能【方法】通过PCR和RT-PCR的方法获得了FoHog1基因序列并进行生物信息学分析,利用PEG介导的原生质体转化法得到了FoHog1基因缺失突变体,分析敲除突变体与野生型的生物学特性差异【结果】FoHog1基因编码一个含有357个氨基酸的蛋白,该蛋白在不同种镰刀菌中高度保守。通过对敲除突变体的研究发现,该基因缺失后菌丝密度下降,产孢量与菌丝干重明显降低,对乙酸钠和氯化铵的利用率下降,对温度、pH及渗透压等外源胁迫更为敏感。通过致病力实验发现,基因敲除突变体的定殖能力有所降低【结论】尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中FoHog1基因参与调控菌丝生长、分生孢子生成、乙酸钠和氯化铵代谢、渗透压胁迫反应及致病相关过程。     

灰葡萄孢侵染垫缺失突变体的筛选及其相关生物学特性的研究

【目的】从农杆菌介导获得的灰葡萄孢RoseBC-3的突变体库中筛选侵染垫缺失突变体菌株,并明确其相关生物学特性。【方法】将菌株接种于洋葱表皮,利用棉兰染色观察侵染垫形成情况,筛选得到一个侵染垫缺失突变体(AT19)。采用形态学方法、离体叶片接种法、钌红染色法、小麦种子幼芽生长抑制法分别对该菌株的菌落培养性状、侵染垫产生情况、致病力、产果胶酶能力以及产植物毒性代谢产物能力进行测定。【结果】筛选灰葡萄孢突变体168株,根据侵染垫形成可分为三类：快速形成侵染垫型(158株)、缓慢形成侵染垫型(9株)和侵染垫形成缺陷型(1株,AT19)。AT19在接种洋葱120 h后依然无法形成成熟侵染垫。该菌株生长较为缓慢,菌落扩展均匀,可以产生分生孢子,对烟草、草莓、蚕豆和豌豆叶片均不能致病,可以产生果胶酶和植物代谢毒性物质。【结论】突变体菌株AT19可以产生果胶酶和植物代谢毒性物质,其致病力缺失与侵染垫产生缺陷相关。研究结果为了解灰葡萄孢侵染垫形成分子机制提供基础材料。     

液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢的生长发育和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要流行致病菌。本文研究果生刺盘孢中液泡分选蛋白CfVps17的生物学功能,为阐明该蛋白调控致病分子机制提供依据。采用over-lap方法构建CfVPS17基因敲除载体片段,使用PEG介导法将敲除载体片段转化至果生刺盘孢原生质体中,通过验证筛选获得突变体菌株ΔCfvps17。构建目的基因CfVPS17回补载体pYF11::CfVPS17,经转化获得ΔCfvps17-C回补菌株。测定野生型、突变体ΔCfvps17及回补菌株ΔCfvps17-C的生物学表型,结果表明,与野生型和回补菌株相比,突变体ΔCfvps17菌丝生长速率、产孢量和附着胞形成率显著降低,突变体菌丝中糖原积累减少,对氯化钠和刚果红胁迫耐受性增强;致病力测定结果表明,突变体ΔCfvps17丧失了对油茶叶片的致病力。液泡分选蛋白CfVps17参与调控果生刺盘孢糖原积累、生长发育、外界胁迫应答和致病力。     

BldM对密旋链霉菌Act12形态发育及抗生素合成的调控

【目的】以多效生防菌株——密旋链霉菌(Streptomyces pactum) Act12为研究材料，探究转录因子BldM对生防链霉菌Act12形态发育及抗生素合成的调控作用。【方法】通过基因工程手段构建bldM基因缺失突变株△bldM及过表达突变株OE-bldM，利用扫描电镜观察、抑菌实验、高效液相色谱检测和实时荧光定量PCR探究缺失突变株△bldM及过表达突变株OE-bldM与野生型(wild) Act12在形态发育、生长速率、寡霉素产量及抗病原菌能力等方面的差异。【结果】经测序验证bldM基因缺失突变体△bldM及过表达突变体OE-bldM均构建成功，其中△bldM寡霉素D产量明显降低且无法形成气生菌丝，而过表达突变株OE-bldM的气生菌丝更加密集，产孢更为丰富。与野生型菌株相比，OE-bldM的寡霉素D产量增加了23%，编码寡霉素核心合成酶基因的转录水平上调了2-3倍，抑菌活性显著增强。【结论】全局性转录调控因子BldM不但能影响Act12气生菌丝及孢子形成，并且参与正调控Act12寡霉素的合成，本研究结果为转录因子BldM的调控功能进行了新的挖掘和补充，并为后续深入研究密旋...     

Ⅲ型效应子GALA对青枯菌在两种寄主植物上致病性的影响

[目的]研究Ⅲ型效应子GALAs对青枯菌OE1-1在不同寄主植物致病性上的影响。[方法]构建青枯菌OE1-1的多种GALA缺失突变体,通过根切和叶片注射等方法研究GALAs对青枯菌OE1-1致病力和细胞内增殖能力的影响。[结果]GALA多基因缺失突变体对寄主烟草的致病力减弱,在烟草体内细菌繁殖能力较野生型明显降低,但在寄主番茄上不影响其致病性。[结论]GALA效应子对青枯菌OE1-1在烟草植株致病性上展现协同作用。     

新疆野果林苹果腐烂病病原菌鉴定及药用植物内生细菌对其抑菌效果

【背景】药用植物内生细菌能产生与寄主植物相同或相似的化合物及一些新的次级代谢产物等,具有促进宿主植物生长、抵抗病虫害、降解有毒有害化合物等作用。【目的】进一步提高苹果腐烂病生物防治的效率,丰富新疆药用植物内生细菌拮抗功能菌株的资源库。【方法】从新疆伊犁新源县和塔城额敏县野果林中采集带腐烂病病斑的果树枝条,分离鉴定苹果腐烂病病原菌,并采用平板对峙法从药用植物内生细菌中筛选对苹果腐烂病具有抑制作用的拮抗菌株。【结果】从两地共分离获得234株分离株,筛选鉴定出25株Valsa malicola和2株Valsa mali;同时,筛选出92株具有抑菌效果的内生细菌菌株,其中70株来自甘草植物内生细菌。【结论】药用植物甘草中富含较为丰富的抗苹果腐烂病病原菌的微生物菌株资源。本研究在新疆野果林苹果腐烂病的生物防治及药用植物内生细菌的开发利用等方面具有重要意义。     

拮抗植物病原真菌链霉菌菌株ZH-356的鉴定及其生防评价

[目的]对实验室分离到的菌株ZH-356进行鉴定并评价其对植物病原真菌的生物防治效果,为研发针对植物真菌病害的生防菌剂提供理论指导。[方法]通过平板对峙法确定菌株ZH-356抗菌谱,并通过16S rRNA基因序列分析确定其种属,利用离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验和患腐烂病苹果树的防治试验评价其生防效果。[结果]菌株ZH-356鉴定为链霉菌属,与直丝紫链霉菌(Streptomyces rectiviolaceus)相似性最高,为99.71%。抗菌谱试验表明,菌株ZH-356对苹果树腐烂病菌、小麦赤霉病菌、小麦根腐病菌和番茄早疫病菌等多种植物病原真菌均具有较强的抑制作用,这种抑制作用可导致苹果树腐烂病菌菌丝变粗、交叉扭曲、分支变少且容易断裂。此外,ZH-356产生的抑菌活性物质对温度和酸碱度具有高度稳定性,并且该活性物质只存在于其胞内,只有当ZH-356遇到植物病原真菌时才会被分泌出来以抑制它们的生长。在离体枝条的苹果树腐烂病菌感染预防试验中,ZH-356对苹果树腐烂病防效可达94%以上,而在患腐烂病苹果树的防治试验中,ZH-356菌制剂对苹果树腐烂病的防效高达100%。[结论]链霉菌ZH-356抑菌谱广,对多种植物病原真菌均具有良好的拮抗活性,可作为防治植物真菌病害的生防菌株,为基于ZH-356菌株的生防菌剂的开发和防治苹果树腐烂病等植物真菌病害奠定了基础。     

云杉腐烂病菌Cytospora piceae全基因组测序及比较基因组分析

【目的】壳囊孢属(Cytospora)真菌引起的林木腐烂病和枝枯病,是一类重要的、分布广泛的枝干病害,可引起重大经济损失和生态破坏。通过全基因组测序和比较基因组学分析,探究不同腐烂病菌的全基因组特征,分析其与寄主选择和致病性相关的基因或基因家族的差异性,将有助于进一步揭示腐烂病菌与寄主互作的分子机制,为腐烂病的有效防治提供基础资料。【方法】采用PacBio测序技术对云杉腐烂病菌Cytosporapiceae进行了全基因组测序和组装,并通过比较基因组学方法,从基因组水平探究引起腐烂病的4种腐烂病菌的基因组的差异,分析其共有的和特有的与致病相关的基因家族。【结果】C. piceae基因组大小为39.25 Mb,GC含量为51.79%。基于单拷贝直系同源基因构建的系统发育树显示,C. piceae与Cytospora chrysosperma的进化关系相近,Valsamali和Valsapyri则更相近。比较基因组学分析表明,4种腐烂病菌均具有重复诱导的点突变(RIP)活性,其中,C. piceae的RIP活性最强。与其他3种腐烂病菌相似,与木质素降解相关的AA3和AA7家族在C. piceae中显著扩张,但木质素降解关键酶AA5家族均缺失;C. piceae和C. chrysosperma基因组中果胶降解关键酶GH28和CE8家族基因的数量与V. mali和V. pyri相近。4种腐烂病菌都含有较多数量的MFS(major facilitator superfamily)超家族转运蛋白和较少的ABC(ATP-binding cassette transporter)超家族转运蛋白,但C. piceae含有更多DHA2、PDR和MDR类转运蛋白。4种腐烂病菌的分泌蛋白的GO分类分子功能主要集中在水解酶活性,其中V. mali含有最多数量的该类别基因;而生物学过程则集中在碳水化合物代谢过程、果胶分解过程和氧化还原过程。在次生代谢核心基因中,C.piceae的PKS基因明显少于V.mali和V.pyri;在C.piceae含有的4个特异性次生代谢基因中,3个为NRPS基因。【结论】4种腐烂病菌含有的碳水化合物活性酶的种类和数量相似,且都具有较强的果胶降解能力。不同腐烂病菌的膜转运蛋白中多药转运体的选择性扩增,以及次生代谢核心基因中NRPS类基因的特异性存在和缺失,表明它们作为重要的致病因子很可能在腐烂病菌寄主选择中发挥了重要的作用。     

暹罗炭疽菌同源异型盒转录因子CsHtf1的生物学功能

【背景】暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)是橡胶炭疽病害的主要致病菌,严重制约着天然橡胶产量。在植物致病真菌中广泛存在同源异型盒转录因子,其参与调控真菌无性生殖、侵染和代谢等诸多方面。【目的】明确在暹罗炭疽菌中鉴定的一个同源异型盒转录因子CsHtf1的生物学功能。【方法】利用同源重组的方法获得Cshtf1基因的敲除突变株,并对其营养生长、孢子产生和致病性等表型进行分析。【结果】Cshtf1基因编码600个氨基酸且含有1个HOX结构域;与野生型相比,Cshtf1敲除突变株营养生长和致病性无显著差异,而突变株分生孢子产量显著降低且黑色素产量增加。【结论】CsHtf1参与调控暹罗炭疽菌的分生孢子及黑色素产生。