基因库构建

923250新的eDNA签因库构建法〔专,日〕/Toa一Fuel/Jo3254一652:05。02.90一JP一025844(13。11.91)05。02。90 as 025844。92一002455/01(21页)〔译自DBA,1992,11(6),92一03088〕 在构建cDNA基因库的方法中包括制备双链 (ds)。DNA、修饰及重新结合。已用此法有效地构建了相对微量。RNA的cDNA基因库。实例:用小鼠Friend细胞的胞质RNA和pol(A)十RNA合成ds eDNA。用NaOH/NaCI修饰此eDNA并通过用含ioXSSC、smM EDTA和50%甲酞胺的溶液处理使之重新结合。回收重新结合的cDNA、连接到噬菌体卜gtl。上并离体包装。测定了cDNA…     

鲤鱼垂体mRNA反转录模板活性的研究

 本实验用不同方法研究鲤鱼垂体mRNA反转录为互补DNA的活性。用硫氰酸胍法,从垂体中提取总RNA,经过Oligo(dT)-纤维素柱层析,得到poly(A)~+RNA。 以mRNA为模板,30％反转录成单链cDNA。利用RNaseH-DNA聚合酶Ⅰ-E.coli DNA连接酶合成双链cDNA。单链cDNA拷贝成双链cDNA。经放射自显影分析,证明合成了全长cDNA。用水解法合成双链cDNA,大多数为不完整的双链cDNA。平末端的双链cDNA连接上Eco RI-linker经Sepharose-4B分离,收集大片段cDNA,与pUC 19载体相连接,经转化构建成10~5克隆/μg mRNA的cDNA文库。     

DNA分析与扩增

920836用盆组聚合酶链反应构建小砚全长血型.蛋白签因〔英〕/Gu,H.一厂B ioehe皿.Biophys.Res.Commun一1991,177(i)一202~208〔译自})BA,1991,10(15),91一08450〕 分别从贫血小鼠脾基因库(质粒pBR322)和小鼠基因库(质粒pUC18)中分出小鼠血型搪蛋自一A基因不完全cDNA克隆(质粒pGP315)和基因组克隆(质粒pGX7,含第一个外显子和转录起始位点附近的序列),并定序。由于缺乏构建小鼠全长血型糖蛋白一A基因的限制位点,用聚合酶链反应拼接这两部分序列克隆擂人的成分,获得全长的重组DNA片段(IO53bp,含小鼠血型糖蛋白A eDNA)。用5种DNA…     

苜蓿豆血红蛋白互补脱氧核糖核酸(cDNA)的合成及其无性繁殖

本文介绍了 cDNA 合成的详细方法。用苜蓿豆血红蛋白 poly A( )mRNA 作模板,在反转录酶作用下合成单股 cDNA(ss-cDNA),然后在 E.coli DNA 聚合酶 I 作用下合成双股 cDNA(ds-cDNA)。采用同聚物尾接方法和合成的内切酶寡核苷酸衔接物连接方法,将 ds-cDNA 与质粒 pBR322 DNA 重组,进行转化,得到对氨苄青霉素抗性(Amp~r)和四环素敏感(TeL~s)的75个转化子。经 cDNA-mRNA 的杂交选择和无细胞体外转译的初筛结果,有两个转化子具有与苜蓿豆血红蛋白 mRNA 有同源性的 cDNA。这种 cDNA 的性质有待于进一步研究.     

DNA分析与扩增

JJ,‘翻920422大片段定位缺失:缝合环聚合酶链反应〔英〕/5 ong,C.…/B ioteeh Forum Enr一1991,s(s)一130一132仁译自DBA,2991,10(12),91-06633〕 用缝合环聚合酶链式反应(PCPCR)在载体中的噬菌体T7启动子与菊花矮小类病毒(CSV)的cDNA序列之间制造缺失,这样,不含外源序列的CSV RNA即可通过T7的离体转录来合成。新方法应用超螺旋质粒pBCSU172作为PCR扩增模板,产生不含要删除区的线性DNA分子。采用与线性分子两端相配对的第三寡核昔酸来制备缝合环状DNA,并用于大肠、杆菌JM109的直接转化。用该法合成了与天然CSV序列一样…     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

920401简化盆组蛋白纯化的遗传方法〔会,英〕/Moks,T.…j Abstr.Pap.Am。Chem.Soe一1991,ZoiMeet.Pt.z一BIOTS〔译自DBA,1991,10(13),91一07234〕 开发了以细菌血清蛋白受体如葡萄球菌蛋白一久和链球菌蛋自一G为基础的基因融合系统,以简化大规模和小规模的重组蛋白纯化。由于IgG和血清白蛋白间的强相互作用,可以一步回收基因融合产物,得到高产量和纯度。在融合蛋白的蛋白一A/G衍生物和目的蛋白之间导人不同专性酶促和化学裂解位点。这样可从纯化的融合蛋白上除去亲和性拖尾,放出生物活性分子。通过设计一种编码2个合成的1 gG一结…     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

921196C产一甲甚一2’脱级核昔5尹三磷酸的合成及其在ONA聚合醉催化的ONA合成中的底物特性〔俄〕/Chid-geavadze,2.G.…了Bioorg.Khim一1901,17(5)、一6了s~654〔译自DBA,1991,10(15),91一10248〕 制备了C产一甲基一2产一脱氧核昔5尹三磷酸,并研究其在DNA聚合酶催化的DNA合成中的底物特性。在各种底物同系物存在下,采用一种14碱基引物、M13mp10DNA、逆转录酶和末端转移酶等,合成了DNA。在反转录反应中,同系物被加成到引物的3产端。三磷酸化合物本身却不能作反转录酶或末端转移酶的底物。在由牛胸腺DNA聚合酶一a和大肠杆菌DNA…     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

931129由各种方法纯化的质粒ONA的Taq循环翻序〔英〕/Hradetzky,D.…1 Bioteeh Forum Eur一1092,9(7~8)一471~472〔译自DBA,1992,11(20),92一11144) DNA模板的纯化是测序中最关键最困难的一步。就DNA得率、花费、碱基范围和碱墓精确率等方面,考察了制备双链DNA的各种方法,包括小型制备一水煮法,小型制备一碱法,氮化艳制备法,Stratagene过柱法,Qiagen过柱法。采用质粒pBlueseript IIKS、ABI Taq引物循环侧序药盒及AIB Taq染料脱氧终止子循环测序药盒,对DNA进行自动测序。Stratagene或Q二age。层析给出高纯度DNA,使测序范围…     

牛生长激素cDNA的分子克隆

我们克隆了与牛生长激素Poly(A)⁺RNA互补的DNA(cDNA)。首先从小牛垂体中提纯总的Pply(A)⁺RNA,用AMV逆转录酶合成单链cDNA,以单链cDNA为模板合成双链cDNA,用多聚G及多聚c谱尾法将双链cDNA克隆到pBR322质粒的Pst I位点上,构建成牛垂体PoIy(A)⁺RNA的cDNA文库。以牛生长激素基因为探针,筛选出7个阳性菌落,经电泳鉴定有两个菌落(1号和2号)含有大于500bp的插入片段。1号克隆经酶切图谱、southeTn blot 杂交及序列分析证实含有牛生长激素的编码序列。     

单克隆抗体γ3重链可变区cDNA的合成与克隆

用异硫氰酸胍法从分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,经oligo(dT)-纤维素柱亲和层析获得poly(A)~ RNA后,用恒定区5′端第122—125号氨基酸密码的互补序列3′A-T-A-G-G-T-G-A-C-C 5′做为引物,进行逆转录酶反应,合成双链cDNA,大小为300bp左右,与重链可变区基因的长度相符。用dC:dG接尾的方法,将ds-cDNA插入pUC19质粒,转化E.coli HB101。分离出重组体之后,经菌落原位杂交,酶切重组质粒DNA及Southern印迹,证明插入片段是重链可变区基因。     

牛催乳素cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达

从牛垂体中分离出总的mRNA,经逆转录酶及大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA,以pBR322作为克隆载体并用加G．C尾的方法进行重组,把重组质粒导人大肠杆菌中,建立了牛垂体mRNA的cDNA文库。用标记的人工合成的牛催乳索基因片段作为探针进行杂交,并从库中筛选到几个阳性克隆,经酶谱分析和DNA序列分析证明克隆中有一个含有全长的牛催乳素cDNA序列。将所获得的克隆进行“剪切”,加上启动子,然后导人大肠杆菌JM 103中并在IPTG诱导下表达。用SDS-PAGE检测,证明有表达产物存在,再通过酶标测定证明该表达产物具有与天然牛催乳素相似的免疫学活性。     

激素和活性多肽

923283贯组人降钙素在大肠杆菌中的高浓度合成:融合蛋白的胶原酶裂解和肚基甘氨酸的a一酸胺化〔英〕/Tajima,M.…了J.Ferment.Bioeng一1991,72(5)一562~367〔译自DBA,1992,11 (5),92一02581〕 将编码甘氨酸伸长的人降钙素(h CT一G行)的合成基因插入tac启动子与lacZ墓因之间。把具有胶原酶识别位点的合成DNA置于hCT一Gly基因下游。培养物在181培养基(1%葡萄糖、1%酵母膏、i%Baeto PePtone、0.2%硫酸钱、0。2%磷酸二氢钾、1,8%磷酸二钠和。。01%硫酸镁,pH7.0)、32℃下通过IPTG诱导培养5小时,使携带质粒pZT2232(含hCT基因和lacZ序…     

农业其它

852421一个编码核酮糖一1,5一二磷酸狡化酶小亚基的豌豆核基因组织特异性和光调节表达〔英〕/Coruzzi,G.…了EMBOJ一1984,3(8)一1671一1679〔译自DBA,1984,3(20),84一09731〕 研究了在豌豆不同组织中编码核酮糖-1,5一二磷酸梭化酶小亚基(rbcs)的多基因族的一个成员表达。豌豆(品种Progressg号)基因组DNA用Bglll消化并连接到IO59DNA上。用““P标记cDNA克隆P5515的插人筛选了重组噬菌体,分离出6个编码的rbcs。将克隆的汇PS一3D的一个EcoRI片段继续克隆到pPR::6上,称为pPS一4.0;把这个含有rb。S基因的E。oRI一Clal片段再克隆…     

植物遗传工程

940738小南瓜花叶病毒外壳蛋白基因:克隆序列分析及其在烟草原生质体中1的表达〔英万Hu,J.S…了Areh.Virol一。1993,130(i一2)一17~31仁译白DBA,1993,12(19),93一11036〕 克隆了南瓜花叶就豆花叶病毒(SqMV)香瓜株系中间部分RNA的互补DNA。分离出SqMVmRNA,通过蔗糖梯度离心分级分离双链cDNA、用E。。Rl DNA一甲基化酶使之甲基化并将EcoRI-亲和性接头连到两侧末端。用EcoRI消化后,将。DNA克隆到质粒pUC18的EcoRI位点上。转化并筛选大肠杆菌DHS感受态细胞。设计了4种寡核普酸引物,用以在SqMV寡核昔酸序列和预测的多聚蛋白…     

采用AMV和M-MLV逆转录酶的直接DNA序列测定方法

最近发表在《Focus》杂志上的几篇文章,论述了几种改进测定含dG·dC或dA·dT同聚物区M13模板序列的方法。包括以AMV(禽类髓细胞瘤病毒)逆转录酶代替DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow fragment),以及仍用Klenow片段但提高测序反应温度等。     

激素和活性多肽

920526在大肠杆菌中表达鸡生长激素及其缺失变体〔俄〕/Gorbulev,V.G.…了Biotekhnologiya一19ox,i一20~25仁译自DBA,1991,10(12),91一06760〕 介绍了重组质粒的构建,该质粒在trp启动子调控下编码全长鸡生长激素(CGH,家禽生长激素)及其缺失变体的生物合成。同时介绍了用大肠杆菌DH一1生产上述蛋白。以质粒pCGHex为基础,构建了含CGH cDNA的质粒PtrpCGH、ptrp CGH一乙一3和ptrp CGH一乙一7,它们分别编码全长CGH、去掉N一端最初3个氨基酸的CGH和去掉N一端最初7个氨基酸的CGH。在基本培养基中加入户引噪丙烯酸进行诱导,转化的…     

DNA分析与扩增

9乙1 156利用消除了单独位点的pCR产生的形式对任何段较进行位点特异性诱变〔英万R ay,F .A。“·,BioTee五niques一xogz,13(3)一s‘2〔译自DBA,1902,11(21),。2一21692〕 使用单独位点消除作用(USE)时,目标DNA被热变性,引物指引的DNA合成与2个诱变引物有关,一个在单独位点引起突变(USE引物),第二个能引入任何所濡的突变。DNA被转入大肠杆菌muts株,以加强两个突变的共分离。用识别单独位点的限制酶消化转化体DNA,用其转化一个适合的大肠杆菌菌株。得到的产物通常有两个突变。与此相比,长引物(LP)USE是以PCR扩增开始,产生具有…     

基因标记、转化、表达与检测

922864降解的PCR引物的一个简单有效的纯化方法〔英〕//Fekete,A.…1 Bioteehnol.Teeh一1901,5 (6)一479~452〔译自DBA,2992,11(3),92一01226〕 引物是在一20~一9。℃下贮存过程中降解的。在8%的琼脂糖凝胶将引物电泳,通过对凝胶进行槽切使主带电析出来。电泳和电洗脱过程只需45分钟。用这种装置也可对PCR样品作这类分析。用异丁醇提取再用乙醇沉淀来回收引物。产率为20~40%,在26Onm的吸收值与在280nm波长上吸收值比率大于1.8。这样纯化后可得到好的扩增效果。使用本法可使流产布氏杆菌(B,”ee乙la abo,‘咎s)519 DNA的一个607bp的…     

基因工程

940470利用固粉寡dT引物分析cONA序列〔英〕/Thom“s,M .G.…泌Nueleie Aeids Res一1993,21(16)一3015~3916〔译自DBA,1993,12(19),93一10795〕 为提高poly(A/T)段的分辫率,研究出一种用PCR给DNA定序的好方法。利用载体侧翼引物(其中一个已用生物素化方法截短)直接从分离的入噬     

利用交换接头技术构建大麦条纹花叶病毒新疆株RNA_2的全长cDNA克隆

本文采用双股交换接头(Crossover linker)技术对已建立的大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA_2 cDNA重组质粒pUBS_(112)进行修饰。使cDNA两端不必要的poly(dG):poly(dC)尾准确地缺失,同时补上了cDNA中相对于RNA_2 5’端区缺少的三个核苷酸TAA,并在cDNA末端插入了预定的限制酶切顺序。通过原位杂交筛选、酶切图谱分析、cDNA两端序列测定等手段,证明已获得BSMV-XJ RNA_2组分的全长cDNA克隆。