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1.
将小鼠cAMP依赖的蛋白激酶(cAPK)催化亚基α(mCα)分别以成熟、麦芽糖结合蛋白(MBP)融合以及N端连续六个组氨酸(His_6)融合的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,且成熟及融合的重组mCα均有明显的蛋白激酶活性,表明蛋白激酶催化核心结构具有相对的独立性。其中His_6-mCα可利用金属离子(Ni ̄(2+))配体亲和层析(Ⅰ-MAC)一步纯化,所得融合蛋白可通过His_6亲合手臂(Tag)固相化于金属离子(Ni ̄(2+))配体亲和树脂上,为进一步利用PhageDisplay多肽库筛选cAPK识别的底物序列和专一性抑制剂打下了基础。 相似文献
2.
NMT在大肠杆菌中的His6融合表达及其纯化研究 总被引:2,自引:0,他引:2
将啤酒酵母NMT基因以N端融合6个组氨酸的形式在E.coliBL21(DE3)中进行了IPTG诱导的表达研究。SDS-PAGE分析确定有与His。-rNMT理论分子量一致的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白的10%左右;表达产物性质分析表明His-rNMT主要以可溶形式存在。在此基础上不受利用固定化金属离子配体亲和层析一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。体外标脾性是His6-rNMT具有与成熟NM 相似文献
3.
cAPK催化亚基的C端融合表达,纯化及其NMT底物活性作用 总被引:1,自引:0,他引:1
将小鼠cAMP依赖蛋白激酶催化亚基α(mCα)基因从3'端截去96bp后与His-tag融合,构建C端融合His6的表达质粒pZPmCα4H。该质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达,目的蛋白mCα4H的表达量与mCα相近。该蛋白在37℃表达时主要以包含体形式存在,而22℃表达时则大部分可溶。利用固定化金属离子(Ni^2+)配体亲和层析,分别从破菌上清涂和包含体中纯化mCα4H,结果表明 相似文献
4.
江浙蝮蛇神经生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化 总被引:2,自引:0,他引:2
将江浙蝮蛇(AgkistrodonhalysPalas,A.h.P.)神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)基因克隆于分泌型原核表达载体pET22b+,以C端融合了6个组氨酸的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了IPTG诱导表达。SDSPAGE分析确定有一比理论值略大的诱导表达条带,其表达量占全菌蛋白质的20%左右,且表达蛋白质主要是以包涵体的形式存在。用6mol/L的盐酸胍溶解包涵体后,利用固定化金属离子(Ni2+)配体亲和层析一步纯化目的蛋白质,纯度可达80%左右。对该重组肽进行变复性研究。利用PC12细胞进行生物活力测定,证明表达产物具有NGF生物活力。 相似文献
5.
曾以水稻蜡质基因5’调控区内一段31 bp 片段为探针,用酵母单杂交法从水稻cDNA 文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此31 bp 片段结合的cDNA克隆,现将其中的pC73 克隆中的插入片段c73 连接到含His6 的表达载体pET28c( + ) 上,在大肠杆菌BL21(DE3) 中进行诱导表达,并用NiNTA 树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞内;表达量占到大肠杆菌总蛋白的10 % 左右;经NiNTA 树脂亲和层析纯化得到的产物纯度达95 % ,可供进一步研究之用。 相似文献
6.
大肠杆菌His6融合表达载体及其表达产物的一步变化 总被引:10,自引:0,他引:10
构建了T7启动子控制下的融合表达载体,使外源蛋白以N端与6个连续的组氨酸残基融合的形式表达。这些载体含有强T7启动子,终止子,翻译起始区,多克隆位点以及噬菌体f1复制起始区,使外源基因不仅可以得到高效表达而且可以利用helper phage包装单链DNA,从而不需亚克隆玉可以直接进行测序及点突变。 相似文献
7.
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(编码3~149氨基酸)cDNA基因,并克隆在质粒pET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL21(DE3)LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合m-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螫合亲和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基本呈一条均一的蛋白质条带。 相似文献
8.
水稻cDNA c73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化 总被引:2,自引:0,他引:2
曾以水稻蜡质基因5’调控区内一段31bp片段为探针,用酵母单杂交法从水稻cDNA文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此31bp片段结合的cDNA克隆,现将其中的pC73克隆中的插入片段c73连接到含His6的表达载体pET28-c(+)上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,并用Ni-NTA树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞 相似文献
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缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(M—CSF)在大肠杆菌中… 总被引:1,自引:1,他引:0
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子cDNA基因,并克隆在质粒pAET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL2LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合M-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基 相似文献
10.
利用PCR技术并进行DNA序列测定,从人脑cDNA库中扩增得到人豆蔻酰CoA蛋白N端豆蔻酰转移酶的编码基因,构建其在T7启动子控制下的成熟型和His6融合型的表达质粒pMF-hNMT3和pMFHT-hNMT2。转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达研究。SDS-PAGE分析结果显示,在37℃条件下表达的各种重组hNMR几乎全是不溶性产物,但在较低温度条件下表达的His6-hNMR绝大 相似文献
11.
将抗癌胚抗原(CEA)单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAKHis, 与修饰的家蚕核型多角体病毒BmBacPAKDNA共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗CEAScFv 基因的重组病毒BmBacScFv。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为28kD, 前者占细胞总蛋白的6 % , 后者为0 .3 mg/ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ni2+IDASepharose6B亲和柱纯化, 前者纯度可达90% 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有CEA 结合活力, 其亲和常数分别为5 .4×108/mol·L- 1 和2.3 ×108/mol·L-1 , 略低于其亲本单抗E7B10 2.7 ×109/mol·L- 1 。 相似文献
12.
13.
将adr亚型HBV的完整X基因克隆到表达质粒pProEXHTb中,实现了X蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达。表达产物全长179个氨基酸残基(其中X蛋白部分154个氨基酸残基),分子量约19.7kD,约占细菌总蛋白的34%。其氨基端融合部分含有6组氨酸肽段,经HisTrapTM亲和层析纯化,一步可达纯度93%。Western印迹分析表明,该表达产物可与HBV感染患者体内的抗X抗体特异性结合。 相似文献
14.
本文用PCR方法获得大肠杆菌热休克蛋白转录因子σ32的编码基因rpoH,并克隆在含有tac启动子的表达载体pUHE中,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了C端融合有6个寡聚组氨酸的σ32。表达产物经金属螯合层析一步纯化,达到SDS-PAGE银染一条带纯度,氨基酸组成分析及N端序列分析结果与文献报道一致。35S细胞内参入实验表明:即使在较低的温度下,表达产物σ32(His)6也能导致热休克蛋白如GroEl、DnaK、Htp的大量合成. 相似文献
15.
T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统 总被引:6,自引:2,他引:6
构建了T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统,这些表达载含有强的T7启动子,翻译起始及终止元件,多克隆位点,线状噬菌体复制起始区等元件,使得该载体就仅可以有效地表达外源基因、还可能利用helper phage诱导包装单链噬菌体,从而不需亚克隆就可以进行突变及DNA序列测定。 相似文献
16.
cIts857基因的克隆、修饰及温敏诱导表达载体 总被引:1,自引:1,他引:1
从噬菌体λDNA(cIindlts857Sam7)克隆出990bP的cIts857基因,经缺失,点突变等修饰改造和DNA序列测定,获得了带有自身启动子区的修饰型cIts857基因(770bp)。进而利用它构建大肠杆菌表达载体pBLMVL2和一套含3种不同阅读框架linker区的表达载体pBLMFV4、5B、6。上述表达载体;用于表达人工合成的牛生长激素(bGH)、人干扰素-γΔC-13和酵母pho85等外源基因,都观察到这些基因产物的温敏表达。这些表明,克隆、修饰并组建到表达载体中的λ噬菌体cIts857基因表达出具有功能作用的转录阻遏蛋白,使上述PL启动子控制下的大肠杆菌表达载体可经温敏诱导而高效表达外源基因产物. 相似文献
17.
抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
将抗真菌蛋白Rs-AFP1和Rs-AFP2全长cDNA插入表达质粒pET-22b/NcoI+SacI位点,构建成融合蛋白表达载体pRAF1和pRAF2.将不含信号肽编码序列的Rs-AFP1和Rs-AFP2cDNA分别插入pET-22b/Ncol+Sacl和pET-22b/Ndel+SacI位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体pRAF3、pRAF4和非融合蛋白表达载体pRAF5和pRAF6.将构建的上述各种表达载体转化E.coliBL21,挑菌落培养,IPTG诱导,使Rs-AFPs基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,pRAF3和pRAF4表达产物的抑菌活性较明显. 相似文献
18.
小鼠金属硫蛋白基因在丝状体蓝藻中的表达及对重金属抗性的提高 总被引:3,自引:0,他引:3
应用蓝藻类金属硫蛋白启动子(smtOP)的金属诱导性,在丝状体蓝藻鱼腥藻(Anabaenasp.PCC7120)中表达具有更高金属结合能力和对Cd2+有选择特异性的小鼠金属硫蛋白基因(mMTⅠcDNA)。构建穿梭表达载体pKTMRE并在大肠杆菌HB101中扩增,经三亲接合转移、链霉素筛选、DNA和蛋白质印迹等方法鉴定得到稳定的转基因工程蓝藻。转基因蓝藻对金属离子吸附能力和较高重金属浓度下放氧活性测定表明,外源基因的表达提高了蓝藻对重金属离子的抗性,是野生蓝藻的1.5~2.0倍。 相似文献
19.
利用RT-PCR技术成功地从人胎盘组织中克隆了膜联蛋白V的cDNA,测序分析表明,与文献报道的核苷酸序列完全一致,交膜联蛋白V的cDNA克隆进T7启动子控制下的表达质粒pET-24a(+)中,经大肠杆菌BL1(DE3)后,经IPTG诱导可高效表达分子量为36kD的膜联蛋白V蛋白,表达产物以可溶形式存在。表达产物占菌体总蛋白的38%左右。表达产物经肝素亲和层析纯化后具有明显的延长部分凝血活酶时间的作 相似文献
20.
利用PCR技术和DNA体外重组方法,将内皮素A型受体(EndothelintypeAreceptor,ETAR)胞内区cDNA克隆到pUC18载体中进行序列分析。结果表明,DNA序列与预期结果完全相符。然后用低熔点琼脂糖回收插入到pUC18载体中的ETAR胞内区DNA片段,连接到pGEX2T融合蛋白表达载体的凝血酶位点下游,转化大肠杆菌JM103,得到的重组质粒命名为2T/ETAR。JM103(2T/ETAR)经30℃培养、IPTG诱导明显表达出ETAR胞内区融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在。包涵体经变性和复性后,用亲和层析一步纯化法获得了较纯的ETAR胞内区融合蛋白,为进一步研究ETAR胞内区的功能打下了良好的基础 相似文献