香菇印gpd-Le和ras-Le启动子的功能分析

利用从香菇菌丝体中克隆的启动子片段gpd-Le(613bp)和ras-Le(715bp)分别连接于报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)的上游,构建了启动子功能活性检测表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp分别与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测。结果表明:香菇gpd-Le启动子在灰盖鬼伞的菌丝中具有较强驱动外源gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察到gfp基因表达的绿色荧光。而香菇ras-Le启动子没有检测到有驱动外源gfp基因表达的活性。     

香菇印gpd-Le和ras-Le启动子的功能分析

利用从香菇菌丝体中克隆的启动子片段gpd-Le(613bp)和ras-Le(715bp)分别连接于报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)的上游,构建了启动子功能活性检测表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp分别与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测。结果表明:香菇gpd-Le启动子在灰盖鬼伞的菌丝中具有较强驱动外源gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察到gfp基因表达的绿色荧光。而香菇ras-Le启动子没有检测到有驱动外源gfp基因表达的活性。     

灰树花gpd-Gf启动子的功能分析

利用从灰树花菌丝体中克隆的gpd-Gf（615bp）启动子片段串联于报告基因gfp上游,构建启动子功能活性检测表达质粒pGg-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pGg-gfp与辅助质粒pCc1001（含有trp1基因）共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测, 结果表明：灰树花gpd-Gf启动子在灰盖鬼伞菌丝中具有较强驱动gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下可以观察到转化子菌丝发出的强烈荧光。     

毛竹PeSCL3基因表达特征及其启动子活性研究

为探讨毛竹(Phyllostachys edulis)SCL3基因的表达特征及其启动子活性,采用同源克隆的方法从毛竹中分离到SCL3同源基因Pe SCL3的编码区(ORF)和上游启动子序列(Pe SCL3p)。序列分析表明,Pe SCL3的ORF为1335 bp,推测编码含444氨基酸的蛋白,该蛋白与水稻(Oryza sativa)的SCL3同源性高达93.9%。Pe SCL3p长度为1358 bp,含有脱落酸(ABA)应答元件ABRE、赤霉素(GA3)应答元件GARE-motif和P-box、干旱诱导MYB结合位点等多种作用元件。实时定量PCR分析结果表明,Pe SCL3在毛竹叶中的表达丰度最高,其次是茎和根,而鞘中的最低;Pe SCL3的表达受GA3的抑制,受ABA、Na Cl和干旱的诱导。转Pe SCL3p∷GUS拟南芥(Arabidposis thaliana)的GUS染色结果表明,根尖、顶端生长点和子叶叶柄均被染成蓝色,尤其根尖的染色最深。这表明Pe SCL3对毛竹的生长发育,尤其是根系,可能起着重要的调控作用。     

长穗偃麦草EeSKOR启动子的克隆及功能分析

为了研究外整流钾通道蛋白(stelar K⁺ outward rectifier channels,SKOR)基因SKOR在长穗偃麦草中的功能,利用热不对称交错PCR(Tail PCR)技术,克隆了长穗偃麦草EeSKOR启动子,并进行启动子顺式作用元件及基因表达分析。结果表明：(1)成功获得长穗偃麦草EeSKOR基因起始密码子上游798 bp启动子序列,命名为pEeSKOR。 (2)EeSKOR启动子除必须具备的核心启动元件外,还含有特异转录因子结合位点、植物激素响应元件、光响应元件、组织特异的启动元件和胁迫响应元件。(3)成功构建植物表达载体pEeSKOR∷GUS,经农杆菌介导的瞬时转化,EeSKOR启动子驱动GUS报告基因可在拟南芥的叶、叶柄和根中表达。(4)实时定量PCR检测显示,在NaCl、PEG、ABA和SA处理下长穗偃麦草EeSKOR基因在根中呈现不同的表达模式,NaCl处理下EeSKOR的表达量呈先下调后上调趋势;PEG处理下EeSKOR的表达量呈上调趋势,且随着时间的延长显著上调;ABA处理下EeSKOR的表达受到抑制且随处理时间延长呈显著下调趋势;SA处理下EeSKOR表现出先上调后下调趋势,且在处理72 h时表达量显著低于正常表达水平。研究认为,EeSKOR基因的表达受NaCl、PEG、ABA和SA的诱导调节。该研究结果为进一步系统研究长穗偃麦草EeSKOR基因功能提供重要理论依据。     

绵羊Myostatin基因启动子的功能分析

相比于Myostatin基因的作用机制而言, 对Myostatin基因转录和表达的调控机制了解很少. 为了更好地了解Myostatin基因5’调控区的结构和功能, 深入研究Myostatin基因的转录调控机制, 在最近的研究中克隆了绵羊Myostatin基因的启动子(Pro)序列(GenBank 登录号为AY918121). 进一步以EGFP为报告基因, 构建了各种长度的野生型MSTNPro^W-EGFP载体和E-box元件突变型MSTNPro^EM-EGFP载体, 通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系或绵羊成纤维细胞后, 对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行荧光定量分析而比较不同条件下绵羊Myostatin基因启动子的转录调控活性. 结果表明, 0.3~1.2 kb的绵羊Myostatin基因启动子都能不同程度地驱动EGFP在C2C12细胞中的转录和表达, 其中1.2 kb片段的转录调控活性最高. 然 而, 将绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体转染绵羊成纤维细胞后并未观察到EGFP的表达, 说明Myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性. 对稳定转染绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体的C2C12细胞进行荧光分析, 结果表明细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin基因的转录和表达. 在C2C12分化状态下, 1.2 kb野生型绵羊Myostatin基因启动子的活性比成肌状态时显著升高, 而1.2 kb E(3+5+7)突变型Myostatin基因启动子的活性在C2C12分化前后并未表现出差别. 这一结果暗示肌肉调控因子MyoD可能是通过与E-box结合而引起Myostatin基因在C2C12分化和生长状态时转录和表达差异的一个原因.     

香菇系统分类研究述评

香菇是一种引起木材腐朽的担子真菌,也是世界上最著名的食用菌之一。我国最早栽培香菇,至今已有８００多年历史。在世界六大商业蘑菇生产中,香菇产量名列第二或第三位。香菇的学名争论由来已久,目前面临两种学名选择,其一是Ｌｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓ（Ｂｅｒｋ...     

斑地锦黄烷酮 3 羟化酶基因及启动子的克隆与分析

该研究以斑地锦茎叶为材料,利用同源克隆结合RACE和Tail PCR法,克隆了1个黄烷酮 3 羟化酶(F3H)基因,命名为EmF3H(GenBank登录号为MW767838),其ORF区为1 092 bp,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示,EmF3H蛋白相对分子质量为40.93 kD,等电点为5.47,属于2 酮戊二酸铁依赖的双加氧酶超家族,其氨基酸序列与油桐的序列相似性为85.5%,在系统进化上为相对独立的一个分支。采用Tail PCR法获得1 604 bp的EmF3H启动子序列,分析发现其内含TAAT box、CAAT box等序列和G box等光反应元件。qRT PCR结果表明,EmF3H基因在不同生长期各组织中均有表达,其中花期的根和果期的果实中表达水平最高。此结果为进一步研究EmF3H基因表达调控奠定了基础,也为完善斑地锦槲皮素生物合成途径提供了新思路。     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

香菇液体发酵高产多糖菌株筛选

通过评价香菇野生菌株发酵产多糖性能,筛选高产香菇多糖菌株.以采自长白山野生香菇通过组织分离获得的6株菌株和2株人工栽培菌株为出发菌株,对不同发酵培养时间菌丝体生物量、胞内多糖含量、胞外多糖含量等进行测试分析,结果表明,8株菌株随着培养时间的延长,菌丝体生物量均有不同程度的增加,但胞内多糖含量和胞外多糖得率变化趋势不同,...     

高效液相色谱法测定金钱菇多糖的单糖组成

采用高效液相色谱法,测定金钱菇多糖的单糖组成.用超声辅助提取金钱菇多糖,通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)衍生水解后的单糖,高效液相色谱法检测衍生物.结果表明：金钱菇多糖由甘露糖(Man)、核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)组成,其摩尔为1．00∶0．90∶0．91∶28．03∶1．58∶0．11.该方法快速、简便、重现性好,可用于测定金钱菇多糖的单糖组成.     

Occurrence of a unique amino acid racemase in a basidiomycetous mushroom, Lentinus edodes

Free -alanine was detected in a cell extract of the fruit-body of an edible basidiomycetous mushroom, Lentinus edodes (Shiitake), by means of reverse-phase high performance liquid chromatography. We also found an amino acid racemase activity in L. edodes fruit-body, and purified the enzyme. The enzyme has a molecular weight of approximately 86,000, and consists of two subunits of identical molecular weight (44,000). The optimal pH of the enzyme activity is around pH 9.5 for both -to- and -to- alanine racemization. The enzyme requires pyridoxal 5′-phosphate as a cofactor. K_m and V_max values for -alanine were 37.3 mM and 520 nmol/min/mg, respectively; for -alanine, they were 9.21 mM and 141 nmol/min/mg, respectively. The equilibrium constant was calculated to be 1.10, which is consistent with the theoretical value for the racemase reaction. The ability of the enzyme to catalyze the racemization of various -amino acids was investigated. The enzyme catalyzes the racemization of -serine (relative reaction rate, 144% of rate for -alanine), -alanine (100%), -homoserine (17.1%), -2-aminobutyrate (5.6%), -glutamate (4.5%), and -asparagine (3.2%). To the best of our knowledge, this is the first report of an amino acid racemase produced by a basidiomycetous mushroom.     

熊蜂生假丝酵母启动子的筛选及强度分析

【背景】熊蜂生假丝酵母(Starmerella bombicola)作为一种非常规假丝酵母菌株,因其具备高产槐糖脂生物表面活性剂的能力而受到广泛关注。然而,由于自身的表达系统并不完善,限制了该菌株的代谢工程改造。【目的】克隆、筛选及鉴定新的系列内源启动子表达元件。【方法】通过对比分析熊蜂生假丝酵母全基因组及9种功能已知目的基因信息,并结合启动子预测网站,筛选获得系列启动子候选序列,以SbGFP (密码子优化后的酵母增强型绿色荧光蛋白)为报告基因进行整合表达,通过绿色荧光蛋白强度及转录水平分析鉴定启动子强度。【结果】在分别以葡萄糖和油酸作为唯一碳源的条件下,启动子PTEF1和PGPD在不同碳源培养条件下均显示出较高的转录水平。启动子PCYP52M1、PUGTA1、PUGTB1及PMOB在以油酸为唯一碳源时具有弱转录活性,而在以葡萄糖为唯一碳源时则未检测到它们具有转录活性,推测它们是油酸诱导型启动子。进一步利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对SbGFP进行转录水平分析,检测结果与绿色荧光表达水平一致。【结论】获得了系列熊蜂生假丝酵母内源性启动子,进一步丰富了该菌株的表达元件,为菌株的代谢工程改造及基因的表达与调控奠定了理论基础。     

大肠杆菌胞内半胱氨酸响应型启动子的筛选表征

【目的】半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用于化妆品、药品、食品等行业,微生物发酵法合成半胱氨酸已成为当前研究的热点。基于比较转录组学分析等技术,筛选并表征大肠杆菌(Escherichia coli)胞内对半胱氨酸浓度变化显著响应的启动子。【方法】在Escherichia coli W3110培养基中外源添加不同终浓度的半胱氨酸,通过比较转录组学分析筛选转录水平显著响应半胱氨酸浓度变化的基因,融合目标基因的启动子片段与荧光报告基因egfp构建启动子文库,进一步测定不同半胱氨酸浓度条件下,含有不同启动子重组菌的绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)荧光强度。【结果】筛选并挖掘了随着半胱氨酸浓度提高而转录水平显著提升的27个基因,并将基因的潜在启动子片段与荧光报告基因egfp融合构建启动子文库,筛选获得对半胱氨酸变化具备特异性响应的启动子P_E2。最后,对P_E2启动子-35区间隔区域AAAT进行随机突变,最终获得在1-7g/L半胱氨酸浓度范围内特异性响应性能显著提高的启动子P_E2-33。...     

An expanded family of fungalysin extracellular metallopeptidases of Coprinopsis cinerea

Proteolytic enzymes, particularly secreted proteases of fungal origin, are among the most important of industrial enzymes, yet the biochemical properties and substrate specificities of these proteins have been difficult to characterize. Genomic sequencing offers a powerful tool to identify potentially novel proteases. The genome of the model basidiomycete Coprinopsis cinereus was found to have an unusually high number of metalloproteases that closely match the M36 peptidase family known as fungalysins. The eight predicted C. cinereus fungalysins divide into two groups upon comparison with fungalysins from other fungi. One member, CcMEP1, is most similar to the single representative fungalysins from the basidiomycetes Phanerochaete chrysosporium, Cryptococcus neoformans, and Ustilago maydis, and to the fungalysin type-protein from Aspergillus fumigatus. The remaining seven C. cinereus predicted fungalysins form a group with similarity to three predicted M36 peptidases of Laccaria bicolor. All eight of the C. cinereus enzymes contain both the signature M36 Pfam domain and the FTP propeptide domain. All contain large propeptides with considerable sequence conservation near a proposed cleavage site. The predicted mature enzymes range in size from 37–46 kDa and have isoelectric points that are mildly acidic to neutral. The proximity of these genes to telomeres and/or to transposable elements may have contributed to the expansion of this gene family in C. cinereus.     

链霉菌启动子及其应用研究进展

链霉菌天然产物因其显著的生物活性一直是新药开发的重要来源,测序技术的发展揭示了链霉菌强大的生物合成潜力。链霉菌中多数次级代谢生物合成基因簇(biosynthetic geneclusters,BGCs)在常规实验条件下表达水平低甚至不表达,这使得相关天然产物的开发受到阻碍。原位激活和异源表达是挖掘链霉菌天然产物的有效方式,启动子作为基因表达的“开关”,在其中发挥着重要作用。因此对启动子的研究可以有效地促进BGCs的激活,从而挖掘新天然产物。本文重点阐述了链霉菌启动子的结构特征及其挖掘表征和设计构建的思路,并列举了链霉菌启动子在天然产物开发中的应用,有望为链霉菌生物合成路径的优化以及全新生物活性物质的发现提供思路和方法学参考。     

Pathway analysis of radiation-sensitive meiotic mutants ofCoprinus cinereus

We have isolated 37 radiation-sensitive mutants of the basidiomyceteCoprinus cinereus. Each mutation is recessive, and the collection defines at least ten complementation groups for survival of gamma irradiation. Four complementation groups define the genesrad3, rad9, rad11 andrad12, which are required both for survival of gamma irradiation and for meiosis. Mutants in each of these four groups fail to complete meiosis and produce mushrooms with greatly reduced numbers of viable spores. Propidium iodide staining of meiotic nuclei showed a characteristic terminal appearance for each mutant: few cells of any of the meiotic mutants progress beyond prophase I, and both condensation and fragmentation or dispersal of meiotic chromatin are frequently observed. Scanning electron micrographs showed that the meiotic mutants make varying numbers (0–6) of basidiospore initials and that few of these initials develop into mature spores. When initials are present they are always symmetrically arrayed on the basidium, regardless of initial number. In quantitative measurements of gamma ray sensitivity, double mutants of every tested combination ofrad3, rad9, rad11 andrad12 consistently showed the same gamma ray sensitivity as the more sensitive single mutant parent of the cross. Therefore, these four genes are in the same pathway for the repair of gamma radiation damage, and this pathway also represents one or more functions essential for meiosis.