重组人白介素—12在银纹夜蛾中的表达纯化及其生物活性

KB细胞经PDBu刺激 ,采用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA ,RT PCR法获得重组人白介素 12 (rhIL 12 )P35和P4 0cDNA。将hIL 12P35cDNA和P4 0cDNA分别克隆到 pAcUW 5 1载体的Polyhedrin和P10启动子下游 ,构建 pAcUW 5 1 IL12转移载体。pAcUW 5 1 IL12与坏死缺陷型线性苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因DNA共转染Sf9细胞 ,获得重组杆状病毒Ac hIL12。该病毒经血腔感染银纹夜蛾幼虫 ,采用亲和层析法纯化rhIL 12 ;SDS PAGE(银染法 )、Westernblot鉴定表达和纯化的产物 ;ELISA检测rhIL 12含量 ;MTT法检测rhIL 12样品生物活性。rhIL 12分子量为 75kD。rhIL 12在Sf9细胞培养中表达水平为 17.8μg/10 6细胞 ;在银纹夜蛾幼虫中表达水平为 2 0 0 - 30 0mg/L血淋巴。纯化的重组rhIL 12样品对经PHA P激活的PBMC有明显的增殖活性 ,且具有明显的促NK细胞杀伤活性的生物活性     

庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用PCR扩增出HGV E2全基因,克隆进杆状病毒表达载体pFASTBACHTa中,构建成重组转座载体pFASTBAC-E2,转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得含HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ELISA方法检测各类血清标本,初步研究HGV E2糖蛋白的抗原性.     

重组人白细胞介素21在毕赤酵母中的分泌表达及活性分析

为了获得有活性的重组人白细胞介素21(rhIL-21),本研究建立了在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达rhIL-21的技术。首先,通过RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增IL-21cDNA,克隆到酵母表达载体pPIC9K中,构建了重组酵母表达载体pPIC9K-hIL21 cDNA;然后,线性化的载体转化毕赤酵母表达菌株GS115,经抗性梯度筛选获得了多拷贝重组酵母菌;加入甲醇诱导培养后,SDS-PAGE和Western blotting检测到培养液中有rhIL-21的分泌表达,相对分子量约为16kD,ELISA结果显示摇瓶表达量可达229.28mg/L;表达上清经阳离子交换介质SPSepharose Fast Flow纯化后,目的蛋白纯度达到95%。细胞增殖试验结果显示该rhIL-21联合刀豆蛋白A(ConA)对人淋巴细胞的增殖具有显著的促进作用。本研究首次成功在毕赤酵母表达系统中分泌表达了有生物活性的rhIL-21,为相关疾病免疫治疗的研究奠定了基础。     

重组hIL-12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性的研究

将含重组白细胞介素12(hIL-12)的杆状病毒(Ac-hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA.根据重组病毒构建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3′末段设计一对引物进行PCR,扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变.但在P45代,P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T→C,517A→G以及630C→T),Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区-168位的G替换突变为T, -136与-135位之间插入一个碱基T,以及-122位缺失一个碱基T.以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变.     

人白细胞介素12在昆虫细胞中的表达

人白细胞介素12(hIL-12)是一种异源二聚体细胞因子,由p40和p35两个亚基通过二硫键连接而成。首先构建了两个表达载体pVL1392-hp40和pVL1393-hp35,并分别与线性化多角体病毒基因组DNA共转染昆虫细胞株Sf9,用目视法筛选出重组病毒AcNPV-hp40和AcNPV-hp35。利用PHA激活的人淋巴细胞增殖试验,在条件培液中检测到重组hIL-12的生物活性,表达量约为1.5～2μg/10⁶细胞。经实时BIA和Northern blot分析,hp35和hp40两亚基在昆虫细胞中获得表达。非还原条件下的Westernblot结果显示,重组hIL-12的表观分子量为76kDa,hp40同源二聚体的表观分子量为92kDa。重组ph40具有明显抑制hIL-12生物活性的作用。     

人白细胞介素12(hIL\|12)基因在杆状病毒表达载体系统中的表达

人白细胞介素12(hIL-12)是细胞介导免疫发生的关键调节因子,也是目前发现的唯一的异源二聚体细胞因子,由P35和P40两个亚基经二硫键连接而成.利用DNA重组技术,分别构建了含hIL-12p35基因和p40基因的重组转移载体质粒pAcAB3-p35和pAcAB3-p40.将两个重组转移载体分别与致死缺陷型线性化苜蓿丫纹液蛾核型多角体病毒(AcNPVBaculoGold LinearizedBaculovirus)基因DNA共转染昆虫细胞,构建出遗传稳定的重组病毒AcNPV-OCC-hIL-12(p35)与AcNPV-OCC——hIL-12(p40).将两种病毒分别感染Sf9细胞,取细胞培养物上清和细胞裂解物上清进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示hIL-12p35和p40两基因均在昆虫细胞中获得表达,且能分泌至胞外.表达产物具有免疫原性.     

重组人IL-4大肠杆菌表达与纯化

根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成人白细胞介素4基因,以pET30a( )为载体构建了重组表达质粒pET30a( )/rhIL-4,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达并超声破菌检测重组蛋白的表达形式。采用5L发酵罐培养工程菌,发酵液OD600为0.6时诱导3.5h收集菌体,检测目的蛋白的表达量。收集的菌体经压榨破菌获得包涵体,通过包涵体变性、层析、透析复性等方法对rhIL-4进行纯化。采用人红细胞白血病细胞(TF-1)测定纯化的rhIL-4的生物活性。测序表明目的基因已插入载体pET30a( )中,重组蛋白以包涵体形式表达,单位体积重组蛋白的表达量达200mg/L发酵液,建立了对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法,最终得率为40mg/L发酵液,纯度大于98%,回收率为20%以上。免疫印迹法检测诱导表达的重组蛋白和纯化的蛋白为IL-4,N端氨基酸序列测定结果与理论相符,生物活性检测纯化的蛋白比活性达2.5×106AU/mg。这为rhIL-4进一步产业化研究建立了基础。     

重组人可溶性PDGFRβ/Fc在昆虫细胞Sf9中的表达

【目的】利用昆虫细胞Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达血小板源性生长因子受体β (PDGFRβ)链膜外区与人IgG Fc片段的可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc,并检测重组蛋白的特异性和生物活性。【方法】采用Bac-to-Bac系统,构建重组转移质粒pFastbac-sPDGFRβ/Fc,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,使目的基因与杆状病毒基因组DNA发生位点特异性重组,获得重组病毒DNA,将其通过脂质体转染昆虫细胞Sf9获得重组病毒。将该重组病毒感染Sf9无血清细胞系,在Sf9细胞中表达sPDGFRβ/Fc,对表达产物进行Western blotting检测和Protein A亲合层析纯化,并进一步通过MTT法检测获得的重组蛋白生物学活性。【结果】重组病毒感染Sf9细胞后,经Western blotting分析,能检测到一条分子量约为97 kDa的特异性条带,与目的蛋白大小相符。通过Protein A亲和层析,获得了纯度达75％以上,表达量为1 μg/mL细胞培养上清的重组融合蛋白,MTT结果显示该重组融合蛋白sPDGFRβ/Fc具有抑制PDGF刺激的Balb/c 3T3细胞增殖的能力。【结论】具有生物活性的重组可溶性受体融合蛋白sPDGFRβ/Fc可在昆虫细胞中成功地得到表达。     

人重组白细胞介素12在CHO细胞中的表达

将人白细胞介素12（interleukin 12, IL-12）两条链p35及p40全长cDNA分别亚克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了pcDNA3/p35a,pcDNA3/p40a,pcDNA3/p35b,pcDNA3/p40b四种真核细胞重组表达质粒,利用磷酸钙共沉淀法转染中国苍鼠卵巢(CHO)细胞. 通过对阳性克隆的筛选鉴定,获得了稳定表达人IL-12的CHO细胞株,活性最高的一株表达量为105 U/ml.此细胞株经半年的传代培养,能够稳定地分泌IL-12.结果显示：IL-12在CHO细胞中的稳定表达受到重组质粒结构、DNA整合、mRNA转录、蛋白质翻译等多因素的影响,IL-12两个亚基在CHO细胞中的共同表达是产生有生物活性IL-12的基础.     

重组hIL—12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性的研究

将含重组白细胞介素12(hIL—12)的杆状病毒(Ac—hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA。根据重组病毒构建的原理,在P35cDNA和P40 cDNA的3′末段设计一对引物进行PCR,扩增出了包括P35cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2．0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第PmP25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变。但在P45代,P35 cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T→C,517A→G以及630C→T),Polyhedrin启动子的 1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区—168位的G替换突变为T,—136与—135位之间插入一个碱基T,以及—122位缺失一个碱基T。以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变。