一种改进的DNA限制酶谱分析法——末端杂交分析法

本文介绍了末端杂交分析法,并就其优缺点与其他酶谱分析方法进行了比较。     

无需凝胶电泳的DNA快速分析仪器——WAVE DNA片段分析系统

随着基因组计划的深入进行 ,对ＤＮＡ的分析技术提出了更高要求。目前分离和分析ＤＮＡ片段的标准方法是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳 ,这种现代电泳技术仍然是一个繁琐冗长的程序 ,不易自动化 ,难于提高分析效率。而且 ,用于检测ＤＮＡ序列变异的基于凝胶的方法 ,其重复性和精密度都不理想。最近 ,出现了一种自动化的可用于检查ＤＮＡ序列改变和ＤＮＡ片段分析的工具 ,其名称为转基因组ＷＡＶＥＤＮＡ片段分析系统。这个系统是第一个商用的ＤＮＡ序列变异检测和ＤＮＡ片段分析的自动化技术。其特点是高通量筛选单核苷酸多态 (ＳＮＰ)和短串…     

蚯蚓纤溶酶组分的分离纯化和分析

通过以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析,从蚯蚓（大平二号, 即赤子爱胜蚓）纯化出的纤溶酶是一组非均一的纤维蛋白水解酶.经DEAE-纤维素离子交换和制备电泳进一步分离纯化,得到12个单一组分. 这些组分的等电点(pI)按照它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱上的顺序从4.0开始依次降低; SDS-PAGE证明, 除3、4外,其余组分均只含一种多肽链,分子质量在22～34 ku之间;用shiff试剂和酚-硫酸染色, 显示1、2、6.5和7是糖蛋白,其中7的糖含量最高; 以BAEE、Chromozym UK和Chromozym PL为底物测定,7的纤溶酶活性最高.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA克隆片段的限制酶切分析

本文采用10种限制性内切核酸酶分析了单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)335株DNA BglⅡ8种克隆片段共12个重组质粒。发现了HSV-2 DNA L链末端区域有限制酶切位点的变异并对HSV-2 DNA单一序列区域和末端重复区域的稳定性进行了初步讨论。本文应用末端标记技术和末端杂交分析法对编码糖蛋白D的HSV-2 DNA BglⅡL片段和含有形态学转化基因的HSV-2DNA BglⅡN片段进行了详细的限制性内切核酸酶物理图谱分析。     

固定化酶一化学发光分析法测定葡萄糖和一种新型葡萄糖传感器的研制

本文提出用固定化酶－化学发光分析法测定葡萄糖并在此基础上构建了一种新型葡萄糖传感器。这种传感器系由固定化酶膜,光敏二极管及醋酸纤维滤膜构成。与其他类型的葡萄糖传惑器相比,它具有灵敏度高、响应速度快、工作稳定等特点,其线性工作范围可达4个数量级,检测下限为O．5ppm,可连续测定200个样品,测定结果与邻甲苯胺法所得结果相一致。     

16S DNA用于结核性胸膜炎的快速诊断

目的建立聚合酶链反应—毛细管电泳（PCR-CE）的方法直接检测结核性胸膜炎患者胸水中的结核分枝杆菌,以达到快速诊断结核性胸膜炎的目的。方法在大连市结核病医院收集2006年11月至2007年2月结核性胸膜炎患者的胸水120份,所有标本都经过结核分枝杆菌抗酸染色镜检和结合菌培养,其中115份为阴性标本,5份为阳性标本。利用16S DNA集保守性和变异性于一体的特点,设计合成通用引物G1：5′-FAM-GGC GGACGG GTG AGTAA-3′,G2：5′-ROX-GGA CTG CTG CCTCCC GTA G-3′,然后将标本进行DNA提取并进行PCR扩增,扩增产物用限制性内切酶HaeⅢ消化,用毛细管电泳来检测结核分枝杆菌。结果115份阴性标本中检测出结核分枝杆菌的有19份,未检测出结核分枝杆菌的有96份,其阳性率为16.52%;5份阳性标本中检测出结核分枝杆菌的有5份,阳性率为100%。结论PCR-CE方法检测结核分枝杆菌具有快速、准确、灵敏的特点,可用于结核性胸膜炎的快速诊断。     

一种海洋琼胶酶的分离纯化、酶学性质研究及降解产物分析

摘要：【目的】对海洋Agarivorans albus QM38菌株所产琼胶酶的纯化工艺和酶学性质进行了研究。【方法】发酵液通过离心、(NH4 ) 2SO4盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析、Sephacry S-100 凝胶过滤等纯化步骤得到SDS-PAGE电泳级纯酶,并用质谱对酶的降解产物进行分析。【结果】得到琼胶酶A,纯化倍数为17.6倍,收率为15.21 %,SDS-PAGE测定其分子量为127.8 kDa。对琼胶酶A进行了进一步的性质分析,其最适反应温度为35 ℃,最适反应pH为7.6,最适底物浓度为0.9 %,多数金属离子为其活性抑制剂。琼胶酶A的降解产物经质谱分析主要为四糖和六糖。【结论】从菌株QM38的发酵液中纯化得到的琼胶酶A具有降解凝胶态琼胶的能力,其分子量与以往报道过的琼胶酶不同。     

神经鞘氨醇-1-磷酸酯裂解酶快速荧光分析技术

经鞘氢醇-1-磷酸酯（S1P）裂解酶（SPL）是催化S1P转化为乙醇胺磷酸酯和十六烷醛的酶,它具有多种生理学和病理功能,因此可以用作疾病标记或药靶。目前用作SPL活性定性的同位素分析法却不尽完美。作者设计出一种用NBD[ω（7-硝基-2,1,3-苯并氧杂二唑-4-）-D-赤红]标记的荧光底物分析技术,     

厌氧菌群SVY42产酶条件分析及产木聚糖酶菌株的分离鉴定

以美国内华达州大盆地温泉采集样品为材料,富集获得纤维素及半纤维素高效稳定降解厌氧菌群SVY42,以巨菌草、甘蔗渣、废菇筒、羧甲基纤维素钠、滤纸、木聚糖为碳源,分析菌群SVY42产内切葡聚糖酶(CMC酶)、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的情况。在此基础上,以木聚糖为底物筛选高产木聚糖酶的菌株。菌群SVY42在以巨菌草作为碳源时的β-葡萄糖苷酶活最高为0.23 U/mL,以木聚糖作为碳源时CMC酶活和木聚糖酶活均为最高,分别为0.31 U/mL和0.35 U/mL。从菌群SVY42中筛选得到1株高产木聚糖酶厌氧菌株SVY42-1,该菌在最适温度41℃和pH 8.0条件下,其木聚糖酶活力为0.26 U/mL,对其进行16S rDNA序列系统进化分析,SVY42-1与已知菌株的最高同源性仅为93.81%,初步鉴定属于新属。     

水稻几丁质酶基因克隆RCH8的DNA结构分析

用DNA外切核酸酶Ⅲ和S1核酸酶生成连续缺失突变体,用Sanger双脱氧链终止法对该克隆进行双向DNA顺序测定,测序全长2049个碱基,初步确定了1057bp的5'端上游顺序,966bp不含内含子的完整编码区和可能的TATAbox等。所编码的322个氨基酸包括N-端20个氨基酸的信号肽,其后40个氨基酸长度的含8个半胱氨酸的hevein结构域和一个催化结构域。     

用于微生物多样性分析的棉田土壤总DNA的提取

目的：探讨适用于微生物多样性研究的棉田土壤微生物总DNA提取方法。方法：采用4种方法提取不同连作和轮作处理的棉田土壤微生物总DNA,比较其纯度、产率、片段大小,并应用ARDRA技术验证其质量。结果：其中3种方法均可获得23kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产率和纯度上有明显差异。改良CTAB-SDS法提取的DNA完整性好,得率为24.20μg.g-1干土,纯化后A260/A280和A260/A230为分别为1.80和1.70,纯化回收率可达70.1%,完全适用于后续的PCR分析。结论：采用该法提取棉田土壤总DNA简便而高效。对该法提取获得的棉田土壤微生物总DNA进行ARDRA和DGGE分析,所得图谱能较全面地反映不同处理间微生物多样性及群落结构的差别,为不同栽培体系下棉田土壤微生物的分子生态学研究提供了基础。     

东亚钳蝎毒液透明质酸酶全基因序列的克隆和结构分析

本研究通过以东亚钳蝎毒腺为研究材料,采用TRIzol法分离透明质酸酶的全基因序列,并从中分离出4个东亚钳蝎透明质酸酶序列,分别命名为BmHYⅠ、BmHYⅡ、BmHYⅢ和BmHYⅣ。BmHYⅠcDNA全长是1423 bp,包括42 bp的5’非翻译区,1230 bp的开放阅读框,编码了一个410个氨基酸,还有151 bp的3’非翻译区;BmHYⅠ中包含5个糖基化位点;与其它物种蛋白质比对结果显示,BmHYⅠ中有10个高度保守半胱氨酸残基形成5个二硫键。BmHYⅠ在二级结构中形成了13个螺旋和14个折叠,其中折叠主要分布在N端和C端。系统进化树结构表明,东亚钳蝎BmHYⅠ与其它蝎子物种透明质酸酶亲缘关系最近,其次是蜘蛛,最后是脊椎动物。而BmHYⅡ、BmHYⅢ和BmHYⅣ序列缺少终止密码子,蛋白序列与BmHYⅠ具有高度同源性。本研究结果为进一步透明质酸酶的功能提供数据参考。     

环洞庭湖四个淡水湖渔场底泥产几丁质酶细菌的筛选鉴定、分布和产酶量研究

为了解淡水湖渔场底泥中产几丁质酶菌株的产酶量和分布情况，对环洞庭湖的4个淡水湖渔场的表层底泥样品进行了无菌采集。利用稀释涂布平板法、点种法和摇瓶发酵法从底泥样品中筛选分离到26株产几丁质酶菌株，几丁质酶活在0.07～0.69 U/mL之间。对26株产几丁质酶菌株进行16S rRNA基因鉴定和系统发育分析。结果表明，26株菌株都分布于变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的芽胞杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和微小杆菌属(Exiguobacterium)。且产几丁质酶细菌在4个淡水湖渔场表层底泥中的分布情况为安乐湖>东湖>北民湖>西湖。对产几丁质酶菌株的降解活力、种类组成及数量分布的研究可为淡水湖渔场底泥中产几丁质酶微生物资源的开发及应用提供参考。     

棉铃虫Ⅰ型和Ⅶ型几丁质酶基因表达规律的比较分析

几丁质酶（chitinase, CHT）在昆虫生长发育过程中主要有降解围食膜、外骨骼、角质层以及肠道内层的几丁质成分,从而参与昆虫的蜕皮和细胞增殖的功能。在本研究中,分析比较棉铃虫I型和Ⅶ型几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域及其时空表达特性,对的进一步功能研究提供重要的素材。首先利用生物信息学在线工具SMART对本课题组前期所获得的几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域进行分析;之后采用qRT-PCR方法研究棉铃虫6龄幼虫不同组织和幼虫不同龄期蜕皮前后的中肠中HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的时空表达特性。结果表明：对几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ结构域进行分析,发现HaCHTⅠ和HaCHTⅦ均具有信号肽序列、催化区域、连接区域,且HaCHTⅠ有一个几丁质结合结构域,而HaCHTⅦ则无;棉铃虫Helicoverpa armigera几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ在6龄幼虫不同组织部位的均有表达,其中HaCHTⅠ在各个部位的表达量没有显著的差异,而HaCHTⅦ在头壳和体壁中表达显著高于其它组织;几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ在棉铃虫幼虫蜕皮前后中肠的表达量变化较大,其中HaCHTⅠ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递减的趋势,在4、5、6龄初期时表达量则是先减后增的趋势,而HaCHTⅦ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递增的趋势,恰与同一时期HaCHTⅠ的表达量相反,在4、5、6龄初期时HaCHTⅦ的表达量呈递减的趋势。棉铃虫HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的结构域和时空表达都存在差异,据此我们测这些差异可能对其功能具有一定的影响。本结果为深入研究几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的功能奠定了基础。     

白蜡虫far3基因cDNA全长克隆、原核表达和酶活分析

脂酰辅酶A还原酶(FAR)可将脂酰辅酶A还原为相应的脂肪醇,在白蜡生物合成中起至关重要的作用。本研究通过cDNA末端快速扩增技术获得白蜡虫Ericerus pela far3基因cDNA全长,其开放阅读框(ORF)1 566 bp。对白蜡虫FAR3编码蛋白进行系统发育分析,发现FAR3与人类Homo sapiens、小鼠Mus musculus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster等物种的FAR聚为一支;成功构建pET-30a eGFP/EpelFAR3原核表达质粒,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞,在浓度为0.05 mmol·L^-1的异丙基硫代半乳糖苷诱导6 h后有较高的蛋白表达量;经Western blot验证,表达蛋白分子量与预估蛋白分子量符合;质谱分析蛋白质分值为3 900,肽段覆盖度74%,所得肽段与理论序列相符;利用底物C24脂酰辅酶A、C26脂酰辅酶A、C28脂酰辅酶A和C30脂酰辅酶A对原核表达蛋白进行活性分析,利用气相色谱进行蛋白活性验证,没有理论产物相应脂肪醇的生成。本研究中白蜡虫far3 cDNA ORF的获得及原核表达的实现,为进一步的功能和组织表达定位研究奠定了基础。     

基于配体捕捞结合HR-ESI-Q-TOF-MS快速鉴定和分离蛇莓的神经氨酸酶抑制剂

流感是一种急性呼吸道疾病,由甲型、乙型和丙型等流感病毒引起。其中,甲型和乙型流感病毒可导致季节性流行甚至全球大流行。流感病毒神经氨酸酶(NA)是病毒复制、传播和发病机制中的关键酶,因而研发神经氨酸酶抑制剂(NAIs)是对抗流感感染的有效途径之一。在中国,许多用于清热解毒的中药单独使用或作为中药配方来治疗流感显示出良好的疗效,但如何从中药中快速分离出活性物质是一个难题。     

水稻EPSP合酶基因的克隆、结构分析和定位

5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶是芳香族氨基酸合成途径中的一个关键酶, 该基因在植物抗除草剂基因工程中具有重要的应用价值. 根据水稻EPSP合酶基因的EST序列设计探针, 在水稻TAC基因组文库中筛选到16个阳性克隆. 对阳性克隆E11进行亚克隆, 由此获得了由3661核苷酸组成的水稻EPSP合酶基因全序列. 序列分析和同源性比较揭示, 该基因由8个外显子和7个内含子组成. 以窄叶青8号/京系17组合构建的DH群体和分子图谱将水稻EPSP合酶基因定位于水稻第6条染色体的上端.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的克隆和序列分析

幽门螺杆菌是消化道疾病的主要致病菌。其有效抗原成份尿素酶B亚单位(UreB)可刺激机体产生保护性的免疫反应。用高保真PCR扩增系统扩增出UreB基因片段,将其克隆至质粒pUC19中,对其全序列进行了测定。克隆的UreB基因序列与报道的序列完全一致。这一研究获得了序列正确的UreB基因,为将来以UreB分子为抗原的疫苗研制工作打下了良好的基础。     

胃癌相关cDNA片段的快速克隆和表达分析

利用差异显示PCR技术获得的一条在胃癌和正常组织有差异表达的表达序列标签(EST)-W123(GenBank登录号为AF150631),通过与GenBank的dbest库进行电子杂交,选取了与其同源度高的若干EST,在它们共有的保守序列设计了用于扩增的寡聚核苷酸引物,利用cDNA末端快速扩增PCR（RACE）技术得到了7条带有polyA尾的3′EST,进行序列分析后,发现它们均是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列,已登录GenBank.采用RNA印迹对目的序列进行初步鉴定,并进行了这些基因的组织分布分析.RACE技术和生物信息学相结合,具有快速、高效的特点,有助于疾病相关基因的克隆.     

绞股蓝β-香树脂醇合酶基因的克隆和序列分析

为克隆绞股蓝的β-香树脂醇合酶基因(β-amyrin synthase,bAS),探讨绞股蓝bAS的性质特征及其与绞股蓝三萜生物合成及调控的可能关系。本研究根据绞股蓝转录组测序的结果设计合成bAS全长扩增引物,采用RT-PCR技术扩增绞股蓝bAS的开放阅读框架(open reading frame,ORF)全长序列并连接克隆载体进行测序,利用ExPASy等在线工具及MEGA-X软件对测序结果做相应的生物信息分析。测序结果显示绞股蓝bAS的cDNA的ORF全长共2 283 bp,编码760个氨基酸。该序列信息已提交GenBank,登录号为GM251742。对绞股蓝bAS的氨基酸序列进行了性质与结构预测和系统发育分析。bAS的全长cDNA序列的成功克隆,为绞股蓝bAS基因结构与功能研究提供了基础,并可为研究绞股蓝三萜合成通路的调节方式提供新的认识。