Activation of STAT3 stimulates AHSP expression in K562 cells

Studies on the chaperone proteinα-hemoglobin stabilizing protein(AHSP)reveal that abundant AHSP in erythroid cells enhance the cells’tolerance to oxidative stress imposed by excessα-hemoglobin in pathological conditions.However,the potential intracellular modulation of AHSP expression itself in response to oxidative stress is still unknown.The present study examined the effect and molecular mechanism of STAT3,an oxidative regulator,on the expression of AHSP.AHSP expression increased in K562 cells upon cytokine IL-6-induced STAT3 activation and decreased in STAT3 knock-down K562 cells.Regulation of AHSP in oxidative circumstance was then examined inα-globin-overloaded K562 cells,and real-time PCR showed strengthened expression of both AHSP and STAT3.ChIP analysis showed binding of STAT3 to AHSP promoter and binding was significantly augmented with IL6 stimulation and uponα-globin overexpression.Dual luciferase reporter assays of the wildtype and mutated SB3 element,an IL-6RE site,in the AHSP promoter in K562 cells highlighted the direct regulatory effect of STAT3 on AHSP gene.Finally,direct binding of STAT3 to SB3 site of AHSP promoter was confirmed with EMSA assays.Our work reveals an adaptive AHSP regulation mediated by the redox-sensitive STAT3 signaling pathway,and provides clues to the therapeutic strategy for AHSP enhancement.     

STAT3激活促进K562细胞中AHSP的表达升高

近年对伴侣分子AHSP的研究结果表明,在?血红蛋白累积导致的病理状态下,大量存在的AHSP可以增强红系细胞的抗氧化能力.但是,氧化胁迫条件下内源性AHSP基因表达的调控机制仍未见报道.本研究探讨了一种抗氧化调控蛋白STAT3对AHSP表达的影响及其分子机制.在K562细胞中,STAT3信号通路的激活剂白介素6(IL-6)可以增加AHSP的表达水平.同时,本底水平干扰STAT3的表达后,AHSP的表达量下降.本研究在?珠蛋白过表达的K562稳定细胞株中检测了AHSP在氧化胁迫条件的表达水平.实时定量PCR的结果显示,AHSP与STAT3的表达都显著增强.进一步,染色质免疫共沉淀的实验证明,IL-6和过表达的?珠蛋白都可以诱导STAT3在AHSP启动子区的结合增强.野生型及突变的双荧光素酶报告基因检测结果显示,AHSP启动子区的SB3位点为一个IL-6应答元件,表明STAT3可以直接调控AHSP基因的表达.最后,通过凝胶阻滞实验再次确认了STAT3在SB3元件上的结合.本研究揭示了一个AHSP在细胞氧化还原状态改变时的补偿性调控机制,即AHSP受到STAT3信号通路的调控.本工作为地中海贫血症治疗中提高AHSP水平的研究方案提供了一些思路.     

定点突变人α99、β82位的血红蛋白及在大肠杆菌中的表达

模拟分析发现血红蛋白两条α珠蛋白链上 99位的 Lys突变为 Cys后 ,它们之间可以形成二硫键 ,两条β珠蛋白链上 82位的 Lys突变为 Cys后可以增加血红蛋白四聚体间氢键的作用 ,分别起到稳定四聚体的作用 .利用寡核苷酸介导的定点突变技术将α99、β82 位的 Lys突变为 Cys.将突变后的血红蛋白插入 p BV2 2 0载体 ,在大肠杆菌中获得了高效表达 ,其表达产物达细菌总蛋白的2 0 %左右 ,并经 Western印迹证实     

血红蛋白种间分子杂交以及树鼩进化地位的探讨

为了探讨树鼩(Tupaia belangeri chinensis)的分类地位及其与灵长类动物的亲缘关系,本文利用血红蛋白种间分子杂交技术,以人类血红蛋白HbA为标准,分析比较了树鼩血红蛋白与原始灵长类动物懒猴(Nycticebus coucang)血红蛋白的结构异同。在碱性条件下,三种血红蛋白的电泳迁移率大小为:人>懒猴>树鼩。树鼩Hb(α_2~(Tup)和β_2~(Tup))和HbA(α_2~Aβ_2~A)杂交可以产生两种杂种分子 (α_2~(Tup)β_2~A和α_2~Aβ_2~(Tup))。HbA和懒猴Hb (α_2~(Nyc)β_2~(Nyc)) 杂交也可产生两种杂种分子(α_2~(Nyc)β_2~A和α_2~Aβ_2~(Nyc))。结果表明,树鼩Hb与懒猴Hb的α链净电荷相似。认为树鼩与懒猴的分类地位相近。     

定点突变人α_(99)、β_(82)位的血红蛋白及在大肠杆菌中的表达

模拟分析发现血红蛋白两条α珠蛋白链上 99位的 Lys突变为 Cys后 ,它们之间可以形成二硫键 ,两条β珠蛋白链上 82位的 Lys突变为 Cys后可以增加血红蛋白四聚体间氢键的作用 ,分别起到稳定四聚体的作用 .利用寡核苷酸介导的定点突变技术将α99、β82 位的 Lys突变为 Cys.将突变后的血红蛋白插入 p BV2 2 0载体 ,在大肠杆菌中获得了高效表达 ,其表达产物达细菌总蛋白的2 0 %左右 ,并经 Western印迹证实     

鸟类血红蛋白的四级结构和残基选择性特征

对目前已知结构的三个鸟类血红蛋白与哺乳类和硬骨鱼类血红蛋白的晶体结构数据进行了比较,发现鸟类、硬骨鱼类和哺乳类血红蛋白具有不同的四级结构特征,鸟类和硬骨鱼类血红蛋白的各亚基间的距离比哺乳类血红蛋白大,其中,α１－β１亚基间的距离为：硬骨鱼类Ｈｂ＞鸟类Ｈｂ＞哺乳类Ｈｂ;α１－β２、α１－α２和β１－β２亚基间的距离以及两个αβ二聚体的距离为：鸟类Ｈｂ＞硬骨鱼类Ｈｂ＞哺乳类Ｈｂ。进一步由一级结构的比较     

在中国壮族家系中发现的一例-α~T/-α~Q复合β~0β~0珠蛋白基因型

本文报道在我国广西隆林壮族中发现一个罕見的HbQ复合α,β地中海贫血家系。先证者女,18岁,贫血面容,肝脾肿大。化学结构分析确证本Hb变异体为HbQ Thailand[α74(EF3)Asp→His]。血红蛋白组成以及α和β珠蛋白基因分析结果表明,先证者的珠蛋白基因型为-α~Q/-α~T复合β°/β°(IVSI-1G→T/Codon17A→T);先证者父的基因型为-‘α~Q/-复合β~O/β~A(IVSI-1G→T/β~A);先证母的基因型为-α~T/αα复合β~O/β~A(Codon17A→T/β~A)。     

血红蛋白突变体的稳定性预测

为了研究提高血红蛋白粘聚体的稳定性,利用计算机同源模建、分子间氢键形成及表观静电势理论,探讨血红蛋白及相应突变体的结构与功能与功能关系。分析发现两个α９９位的Ｌｙｓ突变为Ｃｙｓ后,它们之间可以形成二硫键,两个β８２位的Ｌｙｓ突变为Ｃｙｓ可以增强形成分了间氢键的能力,分别起到稳定四聚体的作用。分析表明,突变体血红蛋白将具有更高的稳定性,从而提高血红蛋白稳定性及借助计算机工具设计新型奕变体提供参考。     

PCR定点突变血红蛋白基因的克隆和筛选

为开展以基因重组血红蛋白为基础的血液代用品研究,我们首先用PCR 突变法扩增出含血红蛋白α、β珠蛋白的串联基因片段,经测序表明,所克隆的α、β基因符合预期设计结果,未发生意外突变。     

对植物血红蛋白功能的新发现——调节NO的生物活性

血红蛋白在植物中广泛存在,对其功能的研究也不断深入。最新研究发现植物血红蛋白除具有运载氧、感应氧等生理功能外,还对植物诸多代谢活动发挥重要的调控作用,而这一作用主要通过调节信号分子NO的生物活性来实现。综述了在正常生长及胁迫条件下,植物血红蛋白对NO生物活性的调节作用,着重阐述缺氧条件下植物血红蛋白在解除NO毒害,再生NAD(P) 及维持能量水平等方面的功能及其机制。植物血红蛋白功能的这一新发现对研究不同条件下NO信号转导途径的调节机制具重要意义。     

植物的血红蛋白

近几年来,植物血红蛋白的研究进展十分迅速,豆科植物中与共生固氮无关的血红蛋白基因和包括禾本科植物在内的许多非豆科植物血红蛋白基因的发现使人们对植物血红蛋白有了新的认识,进而把植物血红蛋白分为共生血红蛋白和非共生血红蛋白两种类型。对这两种血红蛋白的性质、功能、基因结构及表达等方面的研究不仅对共生固氮中植物与微生物的相互关系和固氮工程研究;而且对植物细胞的呼吸代谢和耐涝机理等研究有重要价值。     

β-β交联的Fe(Ⅱ)-Co(Ⅱ)杂化血红蛋白玻尔(Bohr)效应的研究

本文使用500MHz ~1H NMR谱仪研究了β—β交联的β_1 82Lys—β_2 82Lys不对称Fe(Ⅱ)Co(Ⅱ)杂化血红蛋白在去氧状态下其四级结构与溶液 pH的相互关系.实验结果证明,溶液中H~+浓度的减少,有利于血红蛋白从束缚态(T态)向松弛态(R态)方向转化.在可交换质子区(9.0—15.0PPm)由pH的改变所引起的[2(Co)β(Fe)]_A[α(Co)β(Co)]_cXL的~1H NMR谱峰的变化比[α(Fe)β(Co)]_A[α(Co)β(Co)]_cXL的~1H NMR谱峰的变化大.这为研究血红蛋白四个亚基的构象随pH改变而变化的先后次序提供了一定的依据,可以认为,当溶液中H~+浓度减少时,首先使蛋白构象发生改变的应在α—亚基上,而不在β—亚基上.此外,从它们的~1H NMR谱图随pH的变化可推测,溶液中除了 T态和R态之外,还存在着一些中间过渡态.o     

高原鼢鼠和高原鼠兔血液参数和血红蛋白亚型对不同海拔生境的响应

高原鼢鼠和高原鼠兔是青藏高原特有的物种,对高原低氧环境有很强的适应性。本研究测定了不同海拔的高原鼢鼠和高原鼠兔的红细胞数目、血红蛋白浓度、平均红细胞压积、平均红细胞体积等;通过质谱测序明确两种高原动物血红蛋白亚型;采用PAML4.8程序分析两种动物血红蛋白亚基中的正向选择位点;采用同源建模的方法分析正向选择位点对血红蛋白氧亲和力的影响,基于对两种高原动物血液特征的分析,探讨了它们适应低氧的策略。结果表明,随着海拔升高,高原鼢鼠通过增加红细胞数目、减小红细胞体积应答低氧,相反,高原鼠兔通过减少红细胞数目、增大红细胞体积应答低氧;高原鼠兔红细胞中具有α₂β₂成年型血红蛋白和α₂ε₂胎儿型血红蛋白,高原鼢鼠红细胞中只有α₂β₂成年型血红蛋白,但高原鼢鼠血红蛋白氧亲和力和别构效应显著高于高原鼠兔;高原鼢鼠与高原鼠兔的血红蛋白α和β亚基中,正向选择的氨基酸位点数目、位置以及它们的侧链基团极性和取向具有明显不同,这可能是造成两种动物血红蛋白氧亲和力不同的重要原因。总之...     

高效液相色谱技术在儿童血红蛋白病检查中的应用

目的:探讨高效液相色谱技术在儿童血红蛋白(Hb)病检查的意义,并时5356例检测结果进行分析.方法:采集5356例广东地区儿童EDTA-K2抗凝血2ml,采用HPLC方法测定各血红蛋白组分含量.结果:在5356例儿童中,检出血红蛋白病977例(18.24%),其中检出β地中海贫血673例(12.57%),α地中海贫血283例(5.28%),其中包括21例CS型HbH病(0.39%),α复合β地中海贫血8例(0.15%),HbE病8例(0.15%),HbQ病5例(0.09%).结论:广东地区儿童血红蛋白病的发生率高,应用HPLC技术加强对儿童血红蛋白(Hb)病进行筛查,早发现,早预防,指导合理婚配,对优生优育提高人口素质具有重要意义.     

两种血红蛋白病的分子生物学基础的比较

镰形细胞贫血症和地中海贫血症均属于血红蛋白病,血红蛋白是一种含有色素辅基的结合蛋白质,其色素部分是血红素(heme,haem),蛋白质部分是珠蛋白(globin)。血红蛋白是一个四聚体,每个亚单位由一条肽链和一分子血红素组成。构成各种血红蛋白的珠蛋白肽链有7种：α、β、^Gγ、^Aγ、δ、ε和ζ。据统计至今已发现异常血红蛋白200多种,异常血红蛋白携带者有一亿多人。镰贫和地贫都与血红蛋白异常有关,二者的分子生物学基础都涉及到基因突变、缺失而导致某种蛋白链合成障碍,引起融血性贫血,使其发生功能性改变直至致病,但二者又有不同之处,镰贫主要原因是发生了基因的错义突变,而地岔系由于α链或β链合成失去平衡所致．     

胎儿血红蛋白的表达调控

胎儿血红蛋白是胎儿体内主要的血红蛋白类型,是由两条α肽链和两条γ肽链组成的四聚体。出生后胎儿血红蛋白在人体中的表达急剧降低至1%,由两条α肽链和两条β肽链组成的成人血红蛋白取而代之成为主要的血红蛋白类型。β地中海贫血和镰刀型细胞贫血发病原因均基于β-珠蛋白基因发生突变,致使β-珠蛋白合成不足或异常,进而引起一系列临床症状。诸多实验结果及临床疗效表明,提高患者体内γ-珠蛋白的表达可部分替代异常β-珠蛋白从而有效缓解患者的临床症状。随着基因治疗的发展,如何安全高效的再激活胎儿血红蛋白的表达成为治疗β型地中海贫血和镰刀型细胞贫血患者的重要科学命题。本文重点回顾近年来γ-珠蛋白表达的调控机制,以期对寻找更加有效激活胎儿血红蛋白的方法提供参考。     

α-α交联的Fe-Co杂化血红蛋白的轴向键Fe-Nε共振拉曼谱研究

通过将HbA和变异HbC(Glu6→Lys)交联制得的各种Co取代的Fe-Co杂化血红蛋白进行血红蛋白氧合过程的模拟研究,用共振拉曼技术研究它们在载氧、去氧和一氧化碳配位(无IHP或有IHP)时的轴向共价键Fe-Nε(F8-His)伸缩振动证明,在血红蛋白配位过程中,第一个配体配位到β(Fe)亚基上所引起的构象变化比配位到α(Fe)亚基的大;因而,配位分子应首先结合在α(Fe)亚基上,血红蛋白四聚体配位过程T/R态构象根本转变发生在第二个配位之时或之前;而且,可能存在除T、R态外的其它构象状态。     

慢病毒载体介导的转人ahsp基因的β654地中海贫血小鼠的制备

目的：经慢病毒载体介导,制备转人α血红蛋白稳定蛋白基因（ahsp）的β654地中海贫血小鼠。方法：用巢式PCR从人血DNA中获得人ahsp基因,构建含有人ahsp基因的慢病毒载体,制备假病毒,通过卵周隙显微注射手段将其导入β654地贫小鼠的受精卵,经移植至假孕母鼠输卵管,最终孕育出转人ahsp基因的β654地贫小鼠;分析小鼠体内外源ahsp基因的表达情况及其遗传稳定性。结果：共获得了8只人ahsp阳性小鼠,转基因阳性率为32%（8/25）,其中3只同时具有β654突变基因;人ahsp基因在小鼠体内的表达水平维持在小鼠自身ahsp表达量的1%左右,且可稳定遗传至子代。结论：制备了转人ahsp基因小鼠,并可遗传至子代,为在个体水平上研究α血红蛋白稳定蛋白与β地贫之间的关系提供了工具。     

人血红蛋白α,β基因在大肠杆菌中的表达

从人外周血细胞中提取出ＲＮＡ,通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）得到人血红蛋白的α和β基因片段,与ｐＴ７Ｂｌｕｅ质粒连接,然后将α、β基因克隆进ｐＢＶ２２０原核表达载体中,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测序的结果与文献报道一致。宿主菌经热诱导,在１．６×１０５处有特异的蛋白带表达,表达量占总菌体总蛋白的２０％。     

α-α交联的Fe-Co杂化血红蛋白的轴向键Fe-Nε共振拉曼谱研究

通过将HbA和变异HbC(Glu6→Lys)交联制得的各种Co取代的Fe-Co杂化血红蛋白进行血红蛋白氧合过程的模拟研究,用共振拉曼技术研究它们在载氧、去氧和一氧化碳配位(无IHP或有IHP)时的轴向共价键Fe-Nε(F8-His)伸缩振动证明,在血红蛋白配位过程中,第一个配体配位到β(Fe)亚基上所引起的构象变化比配位到α(Fe)亚基的大;因而,配位分子应首先结合在α(Fe)亚基上,血红蛋白四聚体配位过程T/R态构象根本转变发生在第二个配位之时或之前;而且,可能存在除T、R态外的其它构象状态。