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将克隆载体平端切割后,向反应体系中加入dTTP,用TaqDNA聚合酶处理载体,使其3-端带上一个凸出的单碱基T,修饰后的载体可直接与纯化的PCR产物连接。 相似文献
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一种高效克隆PCR产物的方法 总被引:3,自引:0,他引:3
利用TaqDNA聚合酶3′末端非模板依赖性加碱基的特性,制备了3′末端带T载体,与18种PCR产物进行连接反应。结果,阳性克隆率达40%—70%,而对照组小于10%。证明该方法是一种高效节省适用范围广的好方法。 相似文献
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可直接克隆PCR产物的克隆载体的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
本文描述一种构建与PCR产物直接连接的克隆载体的方法。以高拷贝克隆载体pUC118为骨架载体,在pUC118质粒氨苄抗性基因的Eam1105 I 酶切位点上,以点突变的方式封闭Eam1105 I 酶切位点。经转化大肠杆菌JM109证实,该改造过的pUC118质粒,可使宿主细胞仍具有氨苄抗性。将一人工合成的具有两个Eam1105 I 酶切位点的互补寡聚核苷酸链(两端具有BamH I 接头)插入已封闭Eam1105 I 酶切位点的pUC118*载体的BamH I 位点,构成新的克隆载体,此质粒命名为pUC118E。该载体经Eam1105 I 酶切后,可产生3′末端突出一个T碱基的T-载体,能与PCR产物直接连接。
Abstract:A new method for construction of a cloning vector (T-vector) for direct ligation with PCR products was described.The T-vector derived from pUC118 in which the unique restriction site of Eam1105 I in the region of Ampr gene was deleted and an artificial DNA fragment flanking two Eam1105 I was introduced at the site of BamHI.The modified vector was named as pUC118E.A T-vector with 3′over hang end of a single T can be obtained via digesting of pUC118E with Eam1105I.PCR products can be easily cloned with this T-vector. 相似文献
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康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其反义植物表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
以康乃馨(Dianthus caryophyllus L.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,CO)基因的序列设计产合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接pGEM^(R)-Teasy vector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp。共编码304个氨基酸残基,序列分析结果表明该序列与GenBankL35152中的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符,推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的,随 后将此片段反向插入植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建了一反义植物表达载体pBO;又把花特异表达启动子PchsA插入pBI121的HindⅢ Xbal位点构建中间载体pGHB,再把康乃馨ACC氧化酶基因反向插入中间载体pCHB的XbaI Satl位点构建成另一反义植物表达载体pCBO。 相似文献
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一种带有组氨酸标签的新型表达载体的构建及应用 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:利用基因重组技术,对已有载体pSE380进行改造,获得具有组氨酸标签的新型表达载体.方法:以pSE380载体为出发材料,通过一步反向PCR技术在多克隆位点处添加一个六聚组氨酸纯化标签,并用该载体对xdh外源基因进行克隆表达及纯化验证.结果:测序结果显示该标签已成功插入,xdh基因克隆表达及纯化表明,镍柱亲和层析完全可以将重组的表达蛋白纯化,并达到电泳纯级别.融合标签并没有影响的该重组酶的功能.结论:通过一步反向PCR技术成功地获得了改造psE380载体,该技术为载体的相关改造提供了一种方便可行的方法. 相似文献
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当植物从暗中转到光下时 ,其体内叶绿素 (Chl)荧光强度会随照光时间产生有规律的变化 ,这就是植物荧光诱导现象。由于它能够灵敏、快速、简便和无损伤地探测植物体内光合生理状况及环境因子对植物的影响 ,近年来在植物生理、植物生态、农业、林业、环境污染和遥感等领域得到重视和应用[1,2,3]。植物动力学荧光仪有调制式和非调制式两类 ,非调制式荧光仪特别适合于荧光诱导上升曲线及曲线中偏转荧光 (FI)和荧光上升互补面积 (CA)的研究 ,其中FI 是快速简便地探测体内PSII无活性中心相对含量的重要途径 ,后者与光合激发能… 相似文献
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一种新型培养心肌细胞搏动传感器 总被引:1,自引:0,他引:1
王强 《中国应用生理学杂志》1999,15(4):369-371
目的:为记录培养心肌细胞的机械活动,研制一种价廉易做、使用方便的培养心肌细胞搏动传感器。方法:应用光电原理,通过高灵敏光敏三极管制作。结果:该传感器配合各类记录仪可稳定地记录培养心肌细胞搏动频率、收缩力和收缩、舒张的最大速度。结论:本传感器使用方便、工作可靠 相似文献