寡核苷酸诱导的定点突变

蛋白质工程是生物技术中正在开发的一个新领域。由于它是一门从改变基因入手,制造新的蛋白质的技术学科,因此改变基因的方法就成为蛋白质工程的主要内容之一。 十年来由于重组基因和DNA序列分析方法得到成功,因此很多科学家的注意力都集中到研究DNA编码区域序列结构与功能的关系,发展了各种体内,体外突变方法。改变某一特定区域的DNA结构,用以确定DNA特定区域的功能。     

tRNA介导蛋白质工程

在遗传信息从DNA到蛋白质流动的过程中,tRNA携带特异的氨基酸参与蛋白质合成,对于维持蛋白质翻译的忠实性起着非常重要的作用。生物体内共有20种氨酰tRNA合成酶,每一种均对应于一种氨基酸和一个tRNA类型。但是这种翻译过程仅仅限于20种天然氨基酸,因此在进行传统的蛋白质工程研究时常常受到限制。事实上,在蛋白质工程中借助于校正tRNA定点掺入非天然氨基酸可以提供蛋白质的结构信息,改进蛋白质检测与分离的方法,甚至赋予蛋白质某些新的特性。随着生物技术的发展和完善,tRNA介导蛋白质工程将不仅在蛋白质工程中发挥潜能,而且在研制新型生物材料和疾病诊断及药物治疗方面起到推动作用。     

蛋白质工程和蛋白质折叠

蛋白质一级结构决定着高级结构。蛋白质肽链在适宜条件下会自动卷曲形成其相应的高级结构,即自动发生蛋白质折叠,其自动发生的原因和过程仍不十分清楚,但是随着蛋白质工程的日益兴起,这些与折叠有关的问题也愈显重要,就此已有文章进行过讨论[1,2]。反之,如把新兴的蛋白质工程手段(尤其是基因定点诱变技术)应用来研究这些折叠问题,必将推动蛋白质折叠的研究。本文将就蛋白质折叠与蛋白质工程相互影响的一些例子进行讨论。     

点饱和突变技术及其在蛋白质工程中的应用

点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门新兴技术,它通过对目的蛋白的编码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变子。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具,而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。本文概述了几种常用点饱和突变技术,介绍了其在蛋白质工程中的应用状况,讨论了其在应用中的问题,展望了其应用前景。     

用蛋白质工程的方法改良枯草杆菌蛋白酶E(Subtilisin E)的抗氧化性

以含有蛋白酶E基因(aprE)的单链M13mp18-aprE DNA为模板,合成的寡核苷酸5′-3′为诱变引物,用缺口双链法对aprE进行Met-222-Ala点突变。经菌落印迹杂交筛选,选出阳性噬斑。用SaⅡ酶解M13mp18-aprE得到aprE,将它和pPZW103重组,转化中性、碱性蛋白酶缺失宿主菌DB104。经含卡那霉素和脱脂奶粉板筛选和比较aprE限制性内切酶NcoⅠ和SacⅡ水解电泳图谱分析,完成构建一个分泌抗氧化的枯草杆菌蛋白酶E的工程菌PW8888。     

蛋白质工程中的计算机辅助设计

了解蛋白质的序列,三级结构与功能之间的关系,可以用遗传学方法对蛋白质氨基酸的序列进行设计,得到的修饰分子可以具有特殊的医疗效果或重要的工业价值。人机对话式计算机制图(computer graphics)可以显示蛋白质晶体学所揭示的结构信息,并建造结构模型(model)。如果缺乏合适的晶体结构,计算机方法就必须从序列推测蛋白质的构象。推测结构最有效的方法是利用序列的同源性或利用与已知的晶体结构更为普遍的类似性。上述方法的改进需要使用含有蛋白质构造基本形式的数据库。     

蛋白质工程研究与开发的现状

自从1978年美国贺契生(C.A.Hutchison)使用了莱德伯格(J.Lederberg)于1960年推荐使用寡脱氧核糖核苷酸作为体外诱变剂,经他重新确定此诱变剂的顺序,成功地实现了定位突变(Site-directed mutagenesis)试验。     

单克隆抗体研制及应用进展

一、引言1975年出现了世界上第一株单克隆抗体,到1984年Kohler和Milstein因发明该项技术而获得诺贝尔奖金,将杂交瘤技术及单克隆抗体的研制推向高潮,18年来,研制成的抗各种抗原的单克隆抗体,品种不下万种,其中数百种已在医学和生物学的各个领域得到了广泛的应用,生物高技术是能密切与生产相结合的,由此而带来了一种新的产业,许多产品用于人类保健和医疗事业,取得明显的社会效益和经济效益。到九十年代初期,世界单克隆抗体的销售已超过三十亿美元。     

定点突变及非定点突变技术的新进展

1992年是Zoller和Smith的寡核苷酸诱导的定点突变方法发表十周年[1]。这方法发表后的前几年中,以此方法为基础,改进了的定点突变方法,如雨后春笋相继产生,如Kunkel等人(1985),Calter等人(1985)及Tayler和Eck-stein等人(1985)的改进方法。这些改进方法使突变效率得到了很大的提高[2]。可以说定点突变技术在蛋白质工程研究中发挥了很大的作用。随后非定点突变技术也有了新的改进,如错误参入法,饱和突变技术等在用来寻找具有新的活性蛋白质序列中发挥了作用[3]。现综述一下近几年来定点突变及非定点突变技术的发展情况。     

酵母表面展示技术在蛋白质工程中的应用

酵母细胞表面展示技术目前已成为蛋白质工程研究的重要工具,利用此技术可以鉴定蛋白间的相互作用、提高蛋白的亲和力和特异性、增加蛋白的稳定性和表达水平、绘制功能性抗原位图、固定化表达具有生物活性的蛋白和酶等,此项技术的运用代表着蛋白质工程研究中的最新进展.