多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2在SGC7901细胞中同时定位于高尔基体顺面囊和反面囊

多肽:N.乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)在高尔基体中催化粘蛋白型O-糖基化的第一步.首先进行了人ppGalNAcT2多克隆抗体的制备和鉴定,进一步通过对分离的亚细胞结构进行蛋白质印迹分析,免疫细胞化学后共聚焦显微镜观察此抗体和两个高尔基体标记GS28(顺面高尔基体的分子标志)和TGN38(反面高尔基体的分子标志)来研究ppGalNAcT2在SGC7901细胞株中的亚细胞定位.结果表明:约有60%的ppGalNAcT2信号和Gs28共定位,大约36%的ppGalNAcT2信号和TGN38共定位.约有34%的TGN38和ppGalNAcT2信号重叠,而约38%的反面高尔基体标志和ppGalNAcT2重叠.结论是:在SGC7901中,ppGalNAcT2同时定位于高尔基体顺面囊和反面囊中,实验证实了在高尔基体中进行粘蛋白型O-糖基化的起始反应.     

酵母Dop1及其同源蛋白DOPEY对细胞糖基化和囊泡运输影响的研究

蛋白质糖基化是一种保守的翻译后修饰,对多种细胞现象至关重要。在酵母或动物细胞高尔基体中的糖链处理由结构相似的糖基转移酶或糖苷酶催化。囊泡运输等多种因素会影响糖基转移酶在高尔基体中的稳态定位,进而影响糖基化。该研究探讨高尔基外周蛋白Dop1对细胞糖基化和囊泡运输的影响。共聚焦荧光显微镜活细胞成像显示,Dop1主要定位于晚期高尔基体。Dop1及其相互作用蛋白Neo1(P4 ATPase)均参与高尔基体后期的囊泡运输。此外,Dop1介导糖基转移酶Och1的逆向运输而影响糖基化。进一步,哺乳动物DOPEY1和DOPEY2是酵母Dop1的同源蛋白。DOPEY1或DOPEY2的缺失导致高尔基体结构的改变,轻微地影响细胞糖基化。综上,酵母Dop1和哺乳动物DOPEY都参与了细胞后期的蛋白质囊泡运输,并影响高尔基体形态或糖基化。     

拟南芥内膜Na+,K+/H+反向转运体研究进展

拟南芥内膜Na,K~+/H~+反向转运体(Endosomal NHX)的亚细胞定位、离子转运特性及生物学功能阐释取得了重要进展。拟南芥内膜Na~+,K~+/H~+反向转运体包含AtNHX5和AtNHX6两个成员,它们的氨基酸序列相似性为78.7%。研究表明,AtNHX5和AtNHX6具有功能冗余,它们都定位在高尔基体(Golgi)、反面高尔基体管网状结构(TGN)、内质网(ER)和液胞前体(PVC),参与调控耐盐胁迫、pH平衡和K~+平衡等。有报道显示内膜NHXs跨膜结构域存在能够调控自身离子活性的酸性保守氨基酸残基,对其自身功能具有决定性作用。最新研究结果表明,拟南芥内膜NHXs影响囊泡运输和蛋白存贮,并参与生长素介导的植物生长和发育。文中主要对拟南芥内膜NHXs的亚细胞定位、离子转运、功能及应用进展进行了概述。     

胃癌细胞高尔基体的蛋白质组学技术平台的建立

采用蔗糖密度梯度超速离心法分离纯化高尔基体,双向凝胶电泳（2-DE）分离高尔基体蛋白质,用ImageMaster 2D软件分析所得图谱,基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI—TOF MS)鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。结果显示分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱,运用质谱技术鉴定出12个蛋白质,包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白、细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化,双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析,首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线,为胃癌细胞内高尔基体功能的深入研究奠定了基础。     

酿酒酵母荧光定位报告菌株的开发

【目的】为了给外源蛋白在酿酒酵母细胞中的定位提供参考,构建酿酒酵母荧光定位报告菌株。【方法】运用染色体同源重组的方法,将突变的、已进行酵母表达优化的红色荧光蛋白RedStar分别整合到12个酵母细胞器标记蛋白的C端,与之进行融合表达,用特异性引物对每一个酵母荧光定位报告菌株进行PCR扩增和测序验证,用激光共聚焦显微镜进行荧光检测,对线粒体和细胞核进行特异性染料染色,用EGFP标记沙门氏菌已知定位蛋白SipA,与构建的相应荧光定位报告菌株进行共定位。【结果】构建的酿酒酵母荧光定位报告菌株可分别标示酵母细胞的肌动蛋白、晚期胞内体、细胞核、核周质、纺锤体、线粒体、过氧化物酶体、脂滴、初级内吞体、次级内吞体、高尔基体顺面及高尔基体反面。PCR扩增及测序验证、荧光检测、染料与相应报告菌株的共定位、已知定位蛋白SipA与相应报告菌株的共定位均提示报告菌株构建成功。【结论】这些报告菌株的构建,为日后在酵母中观察细胞器动态变化,以及未知蛋白在酵母中的定位提供了基础性工具。     

单克隆抗体MGd1 对胃癌SGC-7901 细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究不同浓度的MGd1对体外培养胃癌细胞SGC-7901增殖及凋亡的影响。方法:采用MTT法测定不同浓度MGd1对SGC-7901生长抑制作用;流式细胞术(FCM)进行细胞凋亡分析。激光共聚焦显微镜观察MGd1抗原(MGd1-Ag)的亚细胞定位。结果:MTT结果显示不同浓度的MGd1均对SGC-7901细胞产生明显的抑制效应(P=0.02);流式细胞术分析发现MGd1可诱导SGC-7901发生凋亡并呈浓度和时间依赖性(P<0.01);共聚焦显微镜结果显示MGd1-Ag主要定位于细胞膜上。结论:以上结果证实胃癌特异性单抗MGd1可抑制SGC-7901的增殖并促进凋亡发生。它可能通过与细胞膜上抗原特异性结合,影响下游信号传导,从而发挥抑制效应。     

单克隆抗体MGd1对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究不同浓度的MGd1对体外培养胃癌细胞SGC-7901增殖及凋亡的影响。方法：采用MTT法测定不同浓度MGd1对SGC-7901生长抑制作用;流式细胞术（FCM）进行细胞凋亡分析。激光共聚焦显微镜观察MGd1抗原（MGd1-Ag）的亚细胞定位。结果：MTT结果显示不同浓度的MGd1均对SGC-7901细胞产生明显的抑制效应（P=0.02）;流式细胞术分析发现MGd1可诱导SGC-7901发生凋亡并呈浓度和时间依赖性（P〈0.01）;共聚焦显微镜结果显示MGd1-Ag主要定位于细胞膜上。结论：以上结果证实胃癌特异性单抗MGd1可抑制SGC-7901的增殖并促进凋亡发生。它可能通过与细胞膜上抗原特异性结合,影响下游信号传导,从而发挥抑制效应。     

荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白在BHK-21细胞亚细胞定位的影响

【目的】探究荧光蛋白标签对马疱疹病毒I型(Equine herpes virus type 1,EHV-1)gD囊膜蛋白亚细胞定位的影响。【方法】以EHV-1基因组为模板利用PCR扩增gD全基因,分别克隆至pAcGFP1-C1和p Ds Red2-N1质粒,构建p Ac-GFP-gD(GFP-gD)和p Ds-gD-Red(gD-Red)重组质粒;将GFP基因插入gD基因信号肽序列之后并克隆至PVAX-1质粒,构建PVAX-S-GFP-gD’(S-GFP-gD’)重组质粒;将Flag标签序列与gD囊膜蛋白N端序列融合后并克隆至p VAX-1表达载体,构建p VAX-Flag-gD(Flag-gD)重组质粒。将4种不同重组真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,通过激光共聚焦显微镜对不同融合蛋白gD进行亚细胞定位。【结果】成功构建4种不同的融合蛋白gD真核表达载体;在BHK-21细胞单独表达时,不同融合蛋白gD绝大部分都定位于高尔基体,极少量定位于细胞核内。【结论】不同插入位点的荧光蛋白标签对gD囊膜蛋白亚细胞定位无明显影响,这对今后研究其它蛋白亚细胞定位提供参考。     

吸毒人群中HIV/HCV核酸和抗体关系的分析

研究了高危人群中HIV/HCV核酸和抗体的关系。从新疆地区采集吸毒人群的血样,并对其进行HIV/ HCV核酸和抗体的检测。320例吸毒人员血浆样品中HCV抗体阳性为80．3％,HIV抗体阳性率为41．9％,HIV 和HCV共感染者为38．3％。HIV RNA与抗体的总符合率为98．8%,在186例HIV抗体阴性样品中可能有2例 为HIV感染的窗口期。HCV抗体和HCV RNA的阳性符合率为92．6％,HCV RNA与HCV抗体的总符合率为 90．0％,以上结果说明在HIV／HCV的高流行区进行HIV／HCV核酸检测可以发现病毒感染的窗口期,而约8% 的HCV抗体阳性样品为病毒核酸阴性,也值得进一步研究。     

BRD7核定位信号的结构分析和功能鉴定

目的:对BRD7的核定位信号进行预测、结构分析和功能鉴定,并考察其对BRD7亚细胞定位的影响。方法:通过生物信息学对BRD7的核定位信号进行预测和结构分析,然后利用绿色荧光蛋白(GFP)介导的直接荧光和间接免疫荧光定位方法分别对核定位信号的功能进行鉴定,并考察其对BRD7亚细胞定位的影响。结果:BRD7的65～96位氨基酸残基具有潜在核定位信号(NLS)的结构特征,该核定位信号包含3簇碱性氨基酸残基,可视为由2个紧密相邻、部分重叠的双向核靶序列NLS1和NLS2组成;并发现NLS及其构成上的NLS1和NLS2均具有介导异源蛋白GFP胞核定位的功能,从而证实BRD7的65～96位残基为BRD7功能性核定位信号所在区域,且单簇碱性氨基酸残基的缺失不足以破坏其核定位信号的功能;同时发现野生型BRD7呈胞核分布,而核定位信号缺失型BRD7主要呈胞浆分布。结论:BRD7的65～96位氨基酸残基为BRD7功能性核定位信号所在区域,在BRD7胞核分布模式中发挥了十分重要的作用。     

酿酒酵母GPCR蛋白Ste2亚细胞定位信号探索

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族蛋白在细胞感受各种胞外信号过程中发挥重要作用。Ste2是酵母细胞中GPCR蛋白之一。大量文献报道了Ste2蛋白突变体对其功能和表达的影响,但关于Ste2亚细胞定位的研究相对较少。这项工作的目的在于确定Ste2亚细胞定位,探究Ste2不同跨膜域、胞内外环状结构域和N端、C端对其亚细胞定位的影响。构建了一系列结构域删除或替换突变体,通过荧光显微镜观察判断不同结构区域对Ste2亚细胞定位的影响,并通过与已知的细胞器标记蛋白共定位观察验证亚细胞定位判读结果。结果显示:野生型Ste2荧光信号出现在质膜和液泡内腔; C端缺失突变体荧光信号出现在质膜和内质网。在N端、C端、各环状结构域序列采用动物GPCR蛋白ORI7、OR17-40相应结构域替换的突变体中,C端替换导致液泡内腔信号消失,质膜信号强于野生型; N端和部分环状结构域替换不同程度减弱或消除了质膜定位,液泡腔内信号类似于野生型;部分突变体在胞内出现点状分布的荧光信号。由此推断:Ste2 N端,第一、第二胞外环状结构域和第三胞内环状结构域可能具有影响Ste2运输定位到质膜的功能;而C端则可能在Ste2离开细胞膜进入液泡的过程中发挥作用。初步确定了Ste2的不同结构区域对其定位的影响,为深入研究GPCR蛋白的亚细胞定位机制奠定基础。     

一个新的C-末端内质网定位信号RFSK

蛋白质的亚细胞定位与其生物学功能有密切的关系。以一个新的小鼠N5一谷氨酰胺甲基转移酶基因mHemk的两个转录剪接本mHemkl和mHemk2（GenBank编号分别为AY456393和AY583759）为材料,进一步分析了该蛋白的亚细胞定位。根据生物信息学预测,在这两个蛋白质C．末端可能分别存在内质网（Ea）定位信号RFSK和KSLK,且这两个蛋白质都可能主要定位于细胞质。分别构建了这两个蛋白质以及相应的删除了C-末端RFSK和KSLK的缺失突变体与加强型绿色荧光蛋白的融合蛋白的表达质粒,并转染到MCF-7细胞中。结果证明mHemkl蛋白中的RFSK基序是一个新的内质网定位信号,但没有足够的证据支持KSLK基序是mHemk2蛋白的内质网定位信号。这两个转录剪接本蛋白不同的亚细胞定位是否表明它们在不同的亚细胞器内有不同的功能仍值得深入研究。     

青海省都兰县藏狐家域范围及重叠度

2006年9月21日至10月21日、2007年1月14～20日、2月6～12日和3月13日至4月8日,应用无线电追踪技术对青海省都兰县沟里乡3只藏狐(2雄,1雌)进行追踪定位,采用Kernel方法计算了3只藏狐的家域面积,确定了该物种的核域,并探讨了不同藏狐个体间家域及核域的重叠状况.结果表明,沟里乡藏狐平均家域面积为6.4±0.4 km2,平均核域面积为1.6±0.2 km2,核域约占家域总面积的1/5～1/4.3只藏狐总体家域面积相差不大,藏狐家域及核域均有一定程度的重叠,家域重叠程度约为50%～60%,核域重叠程度则远远减小,约为7%～20%.     

抗 CD20融合蛋白在 CHO 细胞中的表达及其纯化与鉴定

目的：构建CD20胞外区与Igβ胞外区和人IgG1 Fc融合基因的表达载体,并在CHO细胞中表达。方法与结果：根据已知的IgM的CH2区域和Igp胞外区序列,分别设计PCR引物并进行PCR扩增,然后用重叠PCR法扩增得到900bp的Igp-CH2序列,插入本实验室构建的pIRIS-EGFP-Fc载体,转化大肠杆菌,得到pIRIS-Igβ-CH2-Fc重组质粒,将其转染CHO-K1细胞,在G418抗性培养基中培养,荧光显微镜观察结合ELISA法筛选高表达细胞系,细胞系扩大培养后,通过亲和层析rProteinA柱纯化得到纯度融合蛋白,SDS-PAGE显示目的蛋白去糖基化后,相对分子质量约为42×10^3。结论：得到了Igβ-CH2-Fc重链抗体样分子,并鉴定为糖蛋白;须进一步对所得蛋白的生物学活性进行检测,验证其是否能够通过胞外区蛋白定位于B细胞淋巴瘤细胞表面对B淋巴瘤细胞进行杀伤。     

范可尼贫血互补群E基本特性及抗原表位的生物信息学分析

范可尼贫血互补群E(FANCE)属于FA家族的重要成员之一，参与DNA链间交联损伤修复并在某些肿瘤中起重要作用。本研究运用生物信息学方法对FANCE的同源性、理化性质、亲/疏水性、信号肽、亚细胞定位、跨膜结构、蛋白结构、蛋白质互相作用、B/T细胞优势抗原表位以及肿瘤相关性进行预测。FANCE为无信号肽和跨膜区的疏水性蛋白，主要分布在细胞核和细胞质，具有较高的保守性。其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，含有2个N-糖基化、9个O-糖基化以及48个磷酸化位点，与FANCM、FANCD2、FANCC等蛋白发生相互作用。FANCE具有多个潜在的B/T细胞优势抗原表位和17个抗原决定簇，在急性髓性白血病（LAML）和皮肤黑色瘤（SKCM）中低表达，其低表达显著影响患者总生存率。这为深入研究FANCE在肿瘤中的分子机制提供理论依据，使FANCE可能成为新的治疗靶点。     

白细胞介素－2受体γ链研究新进展

白细胞介素－2受体γ链（interleukin-2 receptorγchain,IL-2Rγc）是约3年前发现的IL-2受体亚单位之一,它不但参与高、中亲和力IL-2R的形成,而且作为细胞因子受体超家族成员参与IL－4、IL－7、IL－9和IL－15受体以及可能的IL－13受体功能性复合物的形成．IL-2Rγc基因结构与功能和蛋白质分子结构以及染色体定位已阐明．IL-2Rγc及信号传导的异常导致人类Ｘ染色体连锁重度联合免疫缺陷病(X-linked severe combined immunodeficiency XSCID)．因此,阐明IL-2Rγc在生理及病理状态下的生物学作用,对了解淋巴细胞的生长发育和分化成熟、免疫应答及其调控等问题都有重要的指导意义．     

抑制mTOR信号通路可增强5-aza-dC对胃癌细胞生长的抑制作用

本实验主要研究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路与DNA甲基化在人胃癌细胞生存活力、细胞周期、相关基因及蛋白表达方面的相互作用．分别单独或联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-dC）、mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin,RAPA）和P13K抑制剂LY294002干预人胃癌MKN45和SGC7901细胞,以MTT检测细胞生存活力,流式细胞术检测细胞周期,real-timePCR检测PTEN,p27^Kip1基因表达情况,亚硫酸氢盐修饰后测序检测DNA甲基化改变,蛋白免疫印迹检测相关蛋白表达情况．结果发现单独应用5-aza-dC对胃癌细胞的抑制作用不明显,当其联合mTOR信号通路抑制剂时则显著抑制胃癌细胞生长（P〈0．01）;抑制mTOR信号通路可增强5-aza-dC使细胞阻滞在G2期的作用;联合用药还能提高抑癌基因PTEN,p27^Kip1的表达,但不影响DNA甲基化状态;LY294002及RAPA使Akt,p70S6K及4E-BPl磷酸化表达显著下降（P〈0．01）,但5-aza-dE并不增强这一效应．以上研究提示mTOR信号通路抑制剂可间接促进DNA甲基化酶抑制剂对胃癌细胞的抑制作用,为肿瘤的治疗提供新思路．     

丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关研究

丝裂原活化蛋白激酶信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一,参与介导细胞生长、发育、分裂、分化等多种生理反应过程。在哺乳动物细胞中存在5个MAPK亚族,分别是ERK1／2、JNK、p38、ERK3／4和ERK5。MAPK通常定位于细胞质中,受激活后移行进入细胞核,并产生相应的生理作用。     

人偏肺病毒融合蛋白F的原核表达及初步应用

为了探讨人偏肺病毒(hMPV)融合蛋白(F)在原核表达系统中的表达效果及其应用价值,用大肠杆菌表达系统表达hMPV F1亚单位蛋白并用镍柱(Ni-NTA)进行亲和层析纯化,并以其为抗原,用Western Blot方法进行人血清抗体检测的探索。根据F蛋白的疏水性、抗原位点和表面可及性的预测结果选择F1亚单位为目标区域,在大肠杆菌BL21中分别得到了带有6个组氨酸(His)标记的不同基因型hMPV的F1亚单位蛋白的高效表达,目的蛋白大小约37.0 kD,主要以包涵体形式存在。Western Blot检测显示表达的目的蛋白可以特异性地结合抗hMPV的豚鼠多克隆抗体以及确定为hMPV急性感染患者的血清,而且与副粘病毒科肺病毒属的呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV)(2和3型)之间没有交叉反应,显示表达的F1蛋白的特异性和抗原性良好。应用该表达蛋白进行部分人群血清抗体检测的探索,结果显示人群血清抗hMPV-F蛋白的IgG抗体总阳性率约为66%~67%,0~2岁组的血清抗体阳性率随年龄增长呈现逐渐下降趋势,新生儿的抗体阳性率最高,达85%左右,>1岁~2岁组幼儿阳性率最低,提示母传抗体的存在。随后各年龄组人群随年龄的增长血清抗体阳性率逐渐增高,>60岁年龄组人群抗体水平最高,上述结果提示<2岁儿童为hMPV的易感人群。     

在甲醇酵母Pichia pastoris胞内表达有活性的辣根过氧化物酶

为了开辟在甲醇酵母 Pichia pastoris中表达 HRP的新途径 ,将编码成熟 HRP同功酶 C基因克隆到表达载体 p PIK3.5K中 .p PIK3.5KHRP转化 GS1 1 5后 ,用 PCR筛选阳性 P.pastoris重组株 ,并用甲醇进行诱导 . Western印迹杂交分析表明目标蛋白 (约为 38k D)能被天然 HRP的多克隆抗体所识别 ,因此活性辣根过氧化物酶已在 P.pastoris胞内表达 .筛选菌株中显示了明显的过氧化物酶活性 ,同时诱导过程中血红素和 Ca Cl2 的加入对过氧化物酶的活力影响不大