青花菜BoSCL3基因的克隆和渍水胁迫下的表达特征分析

为了解SCL3 (scarecrow-like 3)基因的功能,从青花菜(Brassica olreacea var. italica)中克隆得到1个SCL3基因,命名为BoSCL3,其cDNA全长1 355 bp,编码446个氨基酸。BoSCL3分子量为49.96 kD,为疏水性蛋白,与油菜(B. napus)、芜菁(B. rapa)中SCL3蛋白的亲缘关系最近,同科植物的SCL3具有较高的同源性。荧光定量PCR分析结果表明,青花菜BoSCL3基因表达量随渍水胁迫时间延长先下降后上升,推测其可能参与渍水胁迫响应。这为探讨青花菜BoSCL3基因响应渍水胁迫的分子机制提供理论依据。     

Pseudomonas mosselii E1铁载体合成相关基因cysI的克隆与功能初步分析

从棉花根际分离的铁载体产生菌E1,其16SrDNA与Pseudomonas mosselii ATCCBAA-99的同源性为100%。采用三亲本杂交方法将携带转座子Tn5-1063的质粒pRL1063a导入E1中进行转座子插入诱变。利用CAS法,从1000个突变株中,筛选到一株铁载体合成缺失突变株E1-185。利用TAIL-PCR方法,扩增位于Tn5-1063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到E1的cysI基因内。该基因与Pseudomonas entomophila L48的cysI同源性为96%,其CysI氨基酸序列相似性为97%。该基因与半胱氨酸的合成密切相关,而在加有半胱氨酸的CAS平板上,突变株恢复了铁载体产生能力,证明cysI在E1铁载体合成过程中具有重要作用。据推测,cysI可能与铁载体合成途径中关键蛋白acyl-S-PCPs的形成有关。     

番茄LeRma1基因的克隆与表达

以番茄‘哈大粉801’为试材,利用RT-PCR技术,克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因LeRma1（GenBank登录号XM_004243764.1）。对LeRma1基因进行序列分析,并对LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物胁迫（干旱、盐、碱、高温、低温）下的表达和生理特性进行研究,为培育和改良番茄品种提供理论依据。结果表明：（1）序列分析显示,LeRma1基因的cDNA全长序列729 bp,编码242个氨基酸,分子量为27.05 kD,理论pI 7.97;同源分析显示,番茄LeRma1蛋白与马铃薯的一致性最高（91%）。（2）半定量PCR检测表明, LeRma1基因在番茄根、茎、叶、花、果实中均有表达,且表达差异不明显。（3）干旱胁迫下,LeRma1基因在番茄叶片中优势表达,而在整个干旱过程中根部的LeRma1基因表达量变化不明显;抗旱相关基因LEA、 DREB2A、ABI3在干旱胁迫过程中,番茄叶片中均有表达,且其表达量呈上升趋势,而在根部DREB2A、ABI3基因基本没有检测到。（4）干旱胁迫过程中,番茄植株中丙二醛（MDA）含量呈显著升高趋势,质膜系统严重损伤,体内保护酶（SOD、POD、CAT）活性上升,且根部活性总体明显高于叶片。（5）在非生物逆境（盐、碱、高温、低温）胁迫过程中,LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势,且在叶片中均是胁迫3 h后诱导起始增强表达。研究认为,LeRma1基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因,且在叶片中优势表达,说明LeRma1基因对植物耐受干旱胁迫所起的作用存在一定的组织差异性,而且LeRma1基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程,在番茄抵抗其他非生物胁迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。     

芒果SEPALAATA基因的克隆与表达分析

以芒果品种‘吕宋’(Mangifera indica L.Carabao)为试材,利用同源克隆和RACE技术从花序中获得了1个芒果SEPALAATA(SEP)基因cDNA全长,命名为MSEP1(GenBank中登录号为KP702299)。MSEP1基因的cDNA全长为921bp,包含一个长度为726bp开放阅读框,编码241个氨基酸,蛋白质相对分子质量为27.7kD,理论等电点为5.79。序列比对和系统进化树分析表明,MSEP1具有保守的MADS-box及半保守的K区,属于MADS-box家族的SEP亚家族。器官特异性表达分析表明,MSEP1基因在芒果根、茎中表达量较低,在叶片、花芽中表达量较高,而在花序中表达量最高。研究推测,MSEP1基因可能在芒果生殖生长中发挥重要作用。     

甘菊ClHSP70与ClHSP90基因的克隆及表达分析

该研究以甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)为实验材料,通过RT-PCR方法从甘菊转录组数据中分离出热激蛋白合成相关基因,命名为ClHSP70和ClHSP90。序列分析表明,ClHSP70基因ORF全长为2 559bp,编码852个氨基酸,蛋白功能区预测表明含有典型的HSP70蛋白NBD和SBD保守结构域;ClHSP90基因ORF全长为2 094bp,编码697个氨基酸,含有HATPase结构域和HSP90保守结构域。生物信息学分析表明,甘菊ClHSP70与大豆(Glycine max)和烟草(Nicotiana tomentosiformis)HSP70蛋白有较高的一致性,ClHSP90基因编码的氨基酸序列与紫茎泽兰(Ageratina adenophora)HSP90高度相似;实时荧光定量表达分析表明,在42℃处理不同时间,甘菊叶片中ClHSP70和ClHSP90基因表达均在0.5h时显著增加,1h达到最大值,2h后缓慢下降;不同组织表达分析表明,甘菊在42℃处理1h后,ClHSP70在成熟叶中的表达量显著高于嫩叶和根等其他组织;ClHSP90在成熟茎中的表达量最高。研究说明,ClHSP70和ClHSP90基因具有热激蛋白特征,参与了甘菊热胁迫应答过程,该研究结果为以后深入研究其基因功能奠定了基础。     

马尾松PmPGK1和PmGPIC基因的克隆和表达分析

为了解马尾松（Pinus massoniana）磷酸甘油酸激酶1（PGK1）与胞质溶胶葡萄糖磷酸异构酶（GPIC）的功能，采用RACE技术克隆了PmPGK1和PmGPIC基因，并进行了生物信息学分析与亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR技术分析PmPGK1和PmGPIC的表达特性。结果表明，PmPGK1和PmGPIC全长为2 106和1 848 bp，分别编码507和566个氨基酸。PmPGK1和PmGPIC分别定位于叶绿体和胞质溶胶。PmPGK1表达量为新叶 > 老叶 > 新茎 > 根 > 花；而PmGPIC为老叶 > 花 > 新叶 > 新茎 > 根。低温胁迫24 h，PmPGK1和PmGPIC的表达量均随时间延长先降低后升高，且PmGPIC的表达量在处理2 h后即降至较低水平；高浓度CO₂胁迫24 h，PmPGK1的表达量随时间延长呈降低-升高-再降低的变化趋势，PmGPIC的表达下调但变化较不显著。因此，推测PmPGK1主要参与卡尔文循环及叶绿体/质体糖酵解，PmGPIC主要参与细胞质基质糖酵解；PmPGK1、PmGPIC活性在低温胁迫下均受抑制；PmPGK1活性在CO₂胁迫下受到显著抑制，而PmGPIC活性的影响不大。     

苋菜甜菜红素合成相关基因AmMYB1的克隆及表达分析

应用RACE技术,从‘大红’苋菜中克隆到1条MYB基因cDNA全长序列,命名为AmMYB1(登录号为KU557504)。AmMYB1基因开放阅读框为723bp,可编码240个氨基酸。其基因组序列与cDNA比对后显示,AmMYB1基因含有1个内含子。生物信息学分析表明,AmMYB1具有2个连续的MYB结构域,是一个典型的R2R3-MYB;同源分析显示,该基因编码的氨基酸序列与甜菜红素相关BvMYB1的一致性最高,达到54%。亚细胞定位结果显示,AmMYB1蛋白定位于细胞核。实时荧光定量PCR分析表明,AmMYB1基因在‘大红’苋菜叶片红色部位的表达量高于绿色部位;在甜菜红素含量高的叶和茎中表达量明显高于根;在光照条件下表达量高于遮光处理;在红叶品种中的表达量高于绿叶品种。研究结果表明,AmMYB1基因可能是苋菜甜菜红素合成途径中重要的正调控因子。     

菜心SOD基因的克隆及其在低温条件下的表达分析

采用同源克隆法从菜心中获得3个SOD基因,并进行生物信息学分析,采用qRT-PCR分析3个基因在不同组织器官和低温胁迫下的表达模式。结果表明:(1)获得Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD基因的ORF,分别命名为BclCZSD、BclFSD、BclMSD,序列长分别为459、639、696bp,分别编码152、212、231个氨基酸。(2)生物信息学分析显示,3种蛋白均为稳定的亲水性蛋白,均不存在跨膜结构和信号肽,BclCZSD的二级结构以无规则卷曲为主,含有2个Cu/Zn-SOD结构域,BclFSD和BclMSD的二级结构以α-螺旋为主,含有一个相同的Mn/Fe-SOD结构域;进化分析显示BclCZSD和BclMSD与油菜最先聚在一个分支,BclFSD与甘蓝、萝卜、油菜、芜菁聚在一个分支。(3)qRT-PCR结果显示,BclCZSD、BclFSD和BclMSD基因在菜心根、茎、叶和叶柄中均有表达,且在根、茎、叶和叶柄中的表达模式不完全相同;低温条件下,3个基因的表达量随着胁迫时间的延长均呈先升高后降低的变化趋势。研究结果为进一步探讨菜心SOD基因在低温胁迫下的响应机制奠定了基础。     

芒果MSOC1基因的克隆与表达分析

MADS-box转录因子在多种植物的发育过程、特别是花器官的发育过程中发挥着重要的作用。为研究MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,利用RT-PCR和RACE技术分离到1个芒果的SOC1基因,命名为MSOC1(GenBank登录号为KP404094)。MSOC1编码区为733bp,编码223个氨基酸,蛋白质相对分子质量为25.6kD,理论等电点为8.96。序列比对和系统进化树分析表明,MSOC1具有保守的MADS-box及半保守的K区,属于MADS-box家族SOC1/TM3亚家族。组织特异性表达分析表明,MSOC1基因在芒果各个组织部位均有表达,但在茎、叶和花芽中表达量高,而在根和花中表达量低。     

LeWRKY1基因的克隆及分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了番茄LeWRKY1 cDNA（Genbank登录号为FJ654265）全长,用生物信息学的方法对其进行分析,预测其编码的蛋白的定位和功能。同时利用Northern杂交技术分析了JA（jasmonic acid）或SA（salicylic acid）刺激时LeWRKY1在野生型番茄和番茄JA不敏感突变体jail（JASMONATE-INSENSITIVE1）及番茄JA生物合成突变体spr2（prosystemin-mediated responses2）中的表达情况。LeWRKY1 cDNA序列全长1 740 bp,阅读框1 083 bp。生物信息学分析表明LeWRKY1含有1个WRKY结构域和1个C_2H_2型锌指结构。LeWRKY1可能是一种定位于细胞核的DNA结合蛋白,并可能具有转录调控、信号传导功能。表达分析推测LeWRKY1的表达是JA依赖而非SA依赖性的,且LeWRKY1的表达不依赖于生物体内JA的从头合成。     

巨桉BRI1基因的克隆和表达分析

为了解BRI1基因在巨桉中的功能,采用PCR技术克隆了EgrBRI1基因,分析了EgrBRI1的生物信息学和亚细胞定位,并对EgrBRI1基因响应激素和胁迫的差异表达进行了分析。结果表明,EgrBRI1基因全长3 893 bp,编码1 197个氨基酸。EgrBRI1蛋白稳定,空间结构复杂,存在3个motifs,主要定位于细胞膜。茉莉酸甲酯和油菜素内酯(BR)处理后,EgrBRI1基因在叶片中的表达上升,而水杨酸处理则没有明显的变化。盐胁迫和冷胁迫下,EgrBRI1基因表达表现为先下降后上升的趋势。因此,EgrBRI1基因能快速对外施激素做出响应,并在巨桉抗逆方面发挥重要作用,这可能是通过对BR信号的响应来实现的。     

橄榄CaICE1基因的克隆和表达分析

为了解橄榄(Canarium album)抗寒相关转录因子ICE1的调控功能,采用RT-PCR技术克隆了‘福榄1号’的ICE1,命名为CaICE1,并进行生物信息学、qRT-PCR表达模式和相关miRNA预测分析。结果表明,CaICE1 cDNA序列的开放阅读框长度为1 650 bp,可编码549个氨基酸(GenBank登录号MG459422)。Ca ICE1为不稳定亲水性蛋白质,含有跨膜结构、磷酸化位点以及HLH保守结构域,定位于细胞核,与枳的ICE1亲缘关系较近。CaICE1密码子偏好性较弱,AGA、AGG、TGG和CCA可能为其最优密码子群。CaICE1主要在橄榄花、种子和叶中大量表达,-3℃低温胁迫下CaICE1表达水平比常温显著上升。psRNAtarget预测结果表明,CaICE1可能是miR825、miR477、miR5658、miR1436和miR394等多个逆境响应miRNA的靶基因。因此,CaICE1可能在橄榄低温胁迫过程中发挥重要调控作用,且可能受miRNA的调控。     

巨桉EgrGBF1基因的克隆和表达模式分析

G-box结合蛋白(GBF)是一类能够识别并结合G-box的转录因子,广泛参与植物基因响应外界刺激的表达调控。通过巨桉(Eucalyptus grandis)初生生长到次生生长的转录组测序筛选出差异表达基因EgrGBF1,为探讨其在桉树生长发育中的功能,从巨桉中克隆了该基因,并进行了结构和进化分析。结果表明,EgrGBF1编码区长度为984 bp,编码327个氨基酸, 存在2个转录本,分别命名为EgrGBF1α和EgrGBF1β。实时荧光定量PCR结果表明,EgrGBF1α和EgrGBF1β在不同组织中,不同激素、胁迫处理下的表达模式不同,EgrGBF1α主要在茎尖表达,沿节间向下表达量逐渐降低,而EgrGBF1β在韧皮部高表达,在节间的表达量无显著差异。在水杨酸和缺硼处理下,EgrGBF1α和EgrGBF1β的表达趋势相反。EgrGBF1α在缺磷处理168 h的表达量最高,而EgrGBF1β在处理6 h的表达量最高。因此,EgrGBF1在桉树生长发育以及响应胁迫中发挥着重要作用,且转录本EgrGBF1α和EgrGBF1β可能具有不同的功能。     

水母雪莲通气组织形成的相关基因SmLSD1克隆及表达

该研究以水母雪莲为实验材料,通过RT-PCR结合RACE技术克隆了通气组织形成相关基因SmLSD1(GenBank登录号为OL690334),并对该基因在不同胁迫下的表达量及编码蛋白结构进行测定分析。结果表明：(1)水母雪莲SmLSD1基因全长965 bp,包含537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸。(2)同源序列比对发现,水母雪莲SmLSD1蛋白与菊科植物牛蒡LSD1的氨基酸序列相似性最高,达到98.31%。(3)亚细胞定位显示SmLSD1基因主要在细胞核和细胞膜上表达;原核表达显示,SmLSD1基因编码氨基酸的分子量约为18 kD。(4)荧光定量分析显示,SmLSD1基因在根、茎、叶中均有表达,且在叶片中表达量最高;在低温、低氧及紫外胁迫下,SmLSD1基因的表达量下调。研究推测,SmLSD1基因在水母雪莲通气组织的形成以及对逆境胁迫的响应中发挥着重要作用。     

中国南瓜CmNPR1基因的克隆和表达分析

从实验室前期对中国南瓜雌花败育转录组测序结果推测,CmNPR1基因可能在南瓜花发育过程中发挥重要功能。该研究以中国南瓜自交系‘3 1’为试验材料,采用同源克隆方法获得中国南瓜CmNPR1基因CDS序列,通过生物信息学、基因表达以及亚细胞定位分析对该基因进行初步研究, 为进一步研究CmNPR1基因在南瓜花发育中的功能和作用机制奠定基础。结果表明：(1)中国南瓜CmNPR1基因CDS全长1 442 bp,编码480个氨基酸;蛋白序列包含有一个BTB/POZ和一个锚蛋白重复序列(Ank)保守结构域;该蛋白无信号肽和跨膜结构;多序列比对分析结果显示,CmNPR1氨基酸序列与美洲南瓜的亲缘关系最近,为96.05%,其次是印度南瓜,为95.63%。(2)CmNPR1基因在所取样品中花纵径0.5 cm时期表达量最高,且在花不同结构中柱头的表达量最高。(3)通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该蛋白定位于细胞质和细胞核。     

唐菖蒲赤霉素受体基因克隆及表达分析

以唐菖蒲子球为材料,采用RT PCR技术,克隆了1个赤霉素（GA）受体基因,命名为GhGID1a（GenBank登录号为KU525107）。其开放阅读框为1 032 bp,编码343个氨基酸。序列比对结果表明,GhGID1a推导氨基酸序列与百子莲、油棕和海枣等植物的GID1的氨基酸序列相似性较高,分别为82%、78%和77%。50 mg/L GA₃对子球萌发具有促进作用,150 mg/L GA₃会抑制其萌发。实时荧光定量PCR结果显示,GA3处理对GhGID1a基因表达具有反馈抑制作用,GhGID1a表达量随着子球休眠解除而逐渐降低,推测唐菖蒲子球休眠解除可能与GA及其受体基因有关,GA及其受体基因GhGID1a可能参与了调控唐菖蒲的子球休眠与萌发过程。     

玉米生物钟基因ZmPRR1-2的克隆及表达分析

为探究玉米生物钟基因ZmPRR1-2的功能及表达特性,解析玉米光周期途径调控开花的机理,该研究以玉米骨干自交系‘黄早4’为材料,克隆ZmPRR1-2基因的cDNA序列并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析和48 h的昼夜节律表达分析。结果表明：(1)成功克隆获得ZmPRR1-2基因的编码区全长1 554 bp,编码517个氨基酸,编码的蛋白属于PRR基因家族,含有1个REC结构域和1个CCT结构域,多序列比对和系统进化分析显示ZmPRR1-2基因在禾本科植物中高度保守;ZmPRR1-2蛋白属亲水性蛋白,不包含跨膜结构域和信号肽。(2)ZmPRR1-2基因在玉米叶片中的表达量最高,显著高于其他7个组织,表明该基因主要在叶片中发挥功能,而在果穗和花丝中表达量相对较低,且显著低于雄穗中的表达量。(3)昼夜节律表达分析显示,在短日照条件下,ZmPRR1-2基因的表达量于光照3 h后开始逐渐上升,在光照结束后3 h时达到表达高峰;在长日照条件下,于光照6 h后ZmPRR1-2基因的表达量才开始逐渐上升,且在光照结束时达到表达高峰。研究认为,ZmPRR1-2基因...     

穿龙薯蓣DnSQS基因的克隆及表达分析

角鲨烯合成酶(SQS)是植物甾醇和萜类化合物合成的关键酶之一。为了揭示穿龙薯蓣SQS基因的功能,该研究以穿龙薯蓣cDNA为模板,采用PCR方法克隆DnSQS基因,并对得到的序列进行生物信息学分析。采用HPLC方法检测不同组织的薯蓣皂苷元含量,采用实时荧光定量PCR技术分析DnSQS基因在不同组织、激素诱导及非生物胁迫下的表达特征。结果表明：(1)成功克隆得到穿龙薯蓣2个基因DnSQS1与DnSQS2,二者分别编码409和433个氨基酸,但编码的蛋白二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,都存在由α螺旋折叠形成的保守催化中心以及2个富含天冬氨酸的功能结构,都具有2个跨膜螺旋结构,并且都定位于内质网。(2)DnSQS1和DnSQS2与盾叶薯蓣DzSQS的亲缘关系较近,2个DnSQS蛋白在进化上相对保守。(3)不同组织的薯蓣皂苷元含量存在差异,其含量大小依次为叶>根状茎>地上茎>根;DnSQS1与DnSQS2基因在不同组织中的表达也具有显著差异,其中DnSQS1在地上茎中表达水平最高,DnSQS2在叶中表达水平最高。(4)以激素MeJA、ABA、SA、Eth及非生物胁迫H