马铃薯Patatin class—I启动子及信号肽基因的克隆和序列分析

为利用ｐａｔａｔｉｎ ｃｌａｓｓ－Ｉ启动子的块茎表达专一性以达到马苓薯的目的,利用ＰＣＲ技术从马铃薯总ＤＮＡ中扩增出Ｐａｔａｉｔｎ ｃｌａｓｓ－Ｉ启动子及信号肽基因,并将其克隆;序列分析发现该基因片段与已发表ｃＤＮＡ相应片段约９４％同源。     

马铃薯class I patatin基因家族的一个新亚型

马铃薯ｃｌａｓｓⅠ与ｃｌａｓｓⅡｐａｔａｔｉｎ基因是具有不同组织表达专一性的一个多基因家族。用马铃薯ｃｌａｓｓⅡｐａｔａｔｉｎ启动子为探针,从中国马铃薯栽培品种“东农３０３”基因文库中筛选到一个ｃｌａｓｓⅠｐａｔａｔｉｎ基因。测定其ＤＮＡ顺序１．８ｋｂ;它包括ｐａｔａｔｉｎ基因５＇侧翼区１４０７ｂｐ、结构基因３６３ｂｐ。根据５＇端非翻译区顺序,它属ｃｌａｓｓⅠｐａｔａｔｉｎ基因。该基因的５＇侧翼区     

牛生长激素基因在马铃薯中的表达

将牛生长激素基因ｃＤＮＡ 与Ｐａｔａｔｉｎ ＣｌａｓｓＩ启动子及ＮＯＳ３终止子连接,构建了表达载体ｐＰＢＧＴ． 用直接法将表达载体转入农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ） ＬＢＡ４４０４（ｐＲＡＬ４４０４）菌株, 用此菌株转化马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ ）得到再生植株． 经ＮＰＴⅡ活性检测,总ＤＮＡ ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ证明目的基因已整合到马铃薯基因组中．ＲＮＡ 点杂交和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明牛生长激素基因已在转基因马铃薯块茎中转录和表达     

酵母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报告基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＧＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比值,确定它们的功能强度,其中ｐＳＫ－ｋａｎ４０１－４１和ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５－５１两个克隆的插入片段具有较强的启动子功能,并证明这两个片段在酵母Ｋ．ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ中也有启动子功能。     

酶母K.cicerisporus基因组中有启动子功能的DNA片段的克隆

利用以３′－氨基糖苷磷酸转移酶基因（ＡＰＨＩ）为报道基因的一套启动子探针质粒ｐＳＫ－ｋａｎ４０１、ｐＳＫ－ｋａｎ１１０５、ｐＳＫ－ｋａｎ１２３８,从酵母Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｅｒｉｓｐｏｒｕｓ基因组中克隆到８个有较强启动功能的ＤＮＡ片段,分析出３′端ＤＮＡ序列,并在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏ８ｍｙｃｅｓｅ ｌａｃｔｉｓ中通过检测报告基因与３－磷酸甘油醛脱氢酶基因（ＡＰＤＨ）的ｍＲＮＡ表达量的比     

多能硫杆菌RbisCO基因在大肠杆菌中表达产物分析

通过对多能硫杆菌ＲｕｂｉｓＣＯ的基因表达分析表明该基因能够在ｐＢＲ３２２的Ｐ１启动子、ｐｕＣ１９的ｌａｃ启动子以及ｐＫＫ２２３－３的ｔａｃ启动子的启动下,在大肠杆菌中表达,ＲｕｂｉｓＣＯ基因片段在ｐＵＣ１９和ｐＫＫ２２３－３载体上的表达活性较高。进一步对ＲｕｂｉｓＣＯ基因表达产物进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测到了ＲｕｂｉｓＣＯ蛋白质带。     

光合细菌Rhodobacter sphaeroides glnB—lacZ融合子的构建

亚克隆了Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓｇｌｎＢ启动子,以ｐＭＰ２２０为载体构建成ｂｌｎＢ－ｌａｃＺ融合子。将ｇｌｎＢ－ｌａｃＺ、ｎｉｆＨ－ｌａｃＺ、ｎｉｆＡ＝ｌａｃＺ分别导入Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ谷氨酸合酶突变株ｇｌｔＢ、ｇｌｔＤ和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响,试验证明,在ｇｌｔＢＤ突变株中ｎｉｆＨ的表达受阻遏,ｎｉｆＡ表达水平很低。这证明ｇｌｔ基因的突变引     

MHC Class Ib grc—G／C基因的研究进展

ＭＨＣ的ｃｌａｓｓ基因,可分为经典的ｃｌａｓｓ Ｉ和非经典的ｃｌａｓｓＩ,后者称ｃｌａｓｓ Ｉｂ。ｃｌｓｓ Ｉ与β／β Ｔ细胞相关在细胞表面高密度表达,ｃｌａｓｓ Ｉｂ在细胞表面弱表达,其功能尚不清楚,ｃｌａｓｓ Ｉｂ的基因区域中含有一个ｇｒｃ区域,ｇｒｃ基因的ｒｃｃ,ｆｔ,ｄｗ－３三组基因组成。     

乳酸克鲁维酵母高拷贝整合载体的构建及应用

用酿酒酵母２６ｓ ｒＤＮＡ作探针克隆乳酸克鲁维酵母Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ２．２ｋｂ ｒＤＮＡ片段,对其作限制内切酶图谱分析。以该基因片段为同源整合的靶顺序,酿酒酵 ＵＲＡ３基因为选择标记构载体质粒ｐＩＲＫ并对其在宿主Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＷ９８－８ｃ细胞中的整合位点,拷数及稳定性进行测定和分析。     

以粘粒为基础产生重组单纯疱疹病毒HSV1-lacZ的研究

将总长度为１５２ｋｂ的单纯疱疹病毒１型（ＨＳＶ－１）（１７株）基因组分成５个相互间有部分重叠的大片段（约３５－４０ｋｂ）,分别克隆到粘粒ＳｕｐｅｒＣｏｓＭＷ中,依次称为ｃｏｓ４８、ｃｏｓ２８、ｃｏｓ６、ｃｏｓ１４和ｃｏｓ５６（ＤａｖｉｓｏｎＡＪｅｔａｌ,１９９３）。此５个粘粒用ＰａｃⅠ切去粘粒骨架后共转染细胞,可发生同源重组而产生野生型ＨＳＶ－１。以此为基础,利用粘粒ｃｏｓ５６的ＨＳＶ－１ＵＬ４４基因中含有一个ＸｂａⅠ单一酶切位点的特点,将一个两端加有ＸｂａⅠ位点的ＣＭＶ－ｌａｃＺ－ｐｏｌｙＡ片段插入其中,构建成ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ。将ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ与其它４个粘粒经ＰａｃⅠ酶切后,用ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ转染试剂共转染ＢＨＫ－２１细胞,３７℃培养２－３天,开始出现细胞病变及噬斑。５天后将病变细胞连同培养液一起冻融３次,取上清０．１ｍｌ感染新鲜的ＢＨＫ－２１细胞,３７℃培养２４小时,用Ｘ－ｇａｌ染色３０－６０分钟,镜下观察可见大量蓝色噬斑。蓝色噬斑数占噬斑总数的５０％以上。经空斑纯化的蓝斑病毒可稳定传代。这种方法同将外源基因表达盒插入ＨＳＶｔｋ基因中构建成重组质粒,再与ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ共转染细     

鸡AChRγ亚基基因远端E盒子与myogenin的相互作用

业已证明,鸡ｎＡｃｈＲγ亚基基因５＇连接区,－５０９／－３０２,－３２４／＋３６片段可独立激活异源启动子ＳＶ４０的转录活性;γ基因近端两个Ｅ盒子（ＣＡＮＮＴＧ）与生肌调节因子（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）的相互作用及转录激活分析表明,近端两个Ｅ盒于是γ启动子活性必不可少的,但却是不充分的。利用胶阻滞和ＤＮａｓｅⅠ足纹试验观察了鸡ｎＡｃｂＲγ基因远端Ｅ盒子与ＧＳＴ－ｍｙｏｇｅｎｉｎ融合蛋白的相互作用。胶阻滞试验证明,－５３８／－２８８片段可与ｍｙｏｇｅｎｉｎ相互结合,引起（３２）￣ｐ标记的ＤＮＡ片段在ＰＡＧＥ中迁移率减慢,这种胶阻滞现象可被含Ｅ盒子的未标记片段消除,并被抗鸡ｍｙｏｇｅｎｉｎ单克隆抗体或抗血清所改变。ＤＮａｓｅⅠ足纹试验证明,ｍｙｏｇｅｎｉｎ系通过γ基因转录起始点上游－４２９／－４２４及－４６３／－４５８两个Ｅ盒子与γ基因５＇连接区－５３８／－２８８相互作用。     

植物几丁质酶的结构、基因及其表达

植物几丁质酶按其蛋白氨基酸序列结构特征及同源性可分为六类,即：ＣｌａｓｓＩ－Ⅵ。ＣｌａｓＩ在蛋白氨基酸结构上包括三个功能区域,Ｎ－端是富含半胱氨酸的几丁质结合区,约４０个氨基酸;Ｃ－端是酶的催化区,也是酶的主要功能区域,约３００个氨基酸;二者通过一个多变的交联区连接在一起。ＣｌａｓｓⅡ仅具有类似于ＣｌａｓｓⅠ的酶催化区域,而没有几丁质结合区和交联区。ＣｌａｓｓⅢ几丁质酶在氨基酸序列上与ＣｌａｓｓⅠ和Ⅱ没有任何同源性,其中有些具有几丁质酶和溶菌酶双重活性。ＣｌａｓｓⅣ类似于ＣｌａｓｓⅠ,只是在几丁质结合区和催化区缺失了少数氨基酸。ＣｌａｓｓＶ类似于ＣｌａｓｓⅠ,但具有两个重复的几丁质结合区。ＣｌａｓＶＩ与前五类几丁质酶无同源性,但与微生物几丁质酶有同源性。所有的植物几丁质酶都是由一个小的多基因族编码的,一般基因中有二个内含子,都位于催化区内。几丁质酶的表达受病原物和植物激素的诱导而表达,也与植物的发育有关。通过转几丁质酶基因的工程植株分析几丁质酶基因的启动子,已鉴定出负责几丁质酶表达的调控序列。     

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

ＣＳ３是某些肠毒素大肠杆菌菌体表面上的多聚物,它能使病原菌粘附于宿主的小肠上皮细胞上,是致病的重要因素．为了探索ＣＳ３菌毛抗原基因的表达调控机制,根据ＣＳ３亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着ｒｂｓ位点及原核启动子的－１０区和－３５区ＤＮＡ序列．采用基因重组技术将ＣＳ３结构基因上游１２０ｂｐ的ＤＮＡ片段亚克隆进缺乏启动子而只含报告基因ｌａｃＺ的质粒ｐＣＢ２６７中．凝胶滞留和启动报告基因表达的实验证明了ＣＳ３亚基结构基因具有自身的启动子（Ｐｓ）．将该启动子上游区域不同长度的核苷酸片段克隆进ｐＣＢ２６７中,报告基因表达结果表明ＣＳ３结构基因的表达受其上游区域的抑制．核苷酸序列分析发现,在Ｐｓ－３５区上游５５０ｂｐ和８４０ｂｐ处各存在一个富Ａ－Ｔ簇．结合原核启动子的一般作用规律推知,ＣＳ３的表达可能受ＤＮＡ结合蛋白型的正向调节因子的作用．用ＣＦＡ／１菌毛抗原基因的正向调节基因ｃｆａＤ对ＣＳ３基因进行的互补表达试验表明ｃｆａＤ基因不仅可消除上游区对Ｐｓ的抑制,而且可大幅度地提高Ｐｓ的启动能力．在分析表达调控的基础上获得ＣＳ３重组高效表达．同时提出了其表达调控模型．     

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶ ｔｓＫ株辅助下进行复制和包装,并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ,以及它的应用。该质料中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而,该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来,继而装入目的基因。本研究在此基础上,新构建了一     

乳酸克鲁维酵母LAC4启动子的克隆及UASⅡ功能的研究

用ＰＣＲ方法取得乳酸克鲁维酵母ＣＢＳ１４１和ＬＡＣ４基因从－６６１到＝２１ｂｐ区段与大肠杆菌ｌａｃＺ基因融合构建成表达载体ＹＦＤ１１４并转化Ｋ．ｌａｃｔｉｓＹ１６７。通过半乳糖,乳糖,山梨醇或ＩＰＴＧ诱导,我们研究了所克隆的ＡＬＣ４启动子的功能。     

pINC－lacZ逆转录病毒载体的构建及其在小鼠胚胎干细胞中的表达

小鼠胚胎干细胞系（ＥＳ）是从囊胚的内细胞团中建立起来的多潜能胚胎干细胞系。ＥＳ细胞系目前正广泛用于将基因打靶后的突变和其它遗传变化导入小鼠的种系中。其中,嵌合鼠的获得是非常必要的一步。这就需要用一个可以广泛表达的基因对ＥＳ细胞进行标记。大肠杆菌β－半乳糖苷酶（β－ｇａｌ）基因的表达在细胞水平就能很容易地观察到,而且对哺乳动物细胞没有任何毒害作用,因而是一个被广泛地用于各种细胞基因表达研究中的报导基因。猿类巨细胞病毒早期（ＳｉＣＭＶＩＥ）启动子是一个广泛用于转基因小鼠研究中的强启动子。然而,该启动子在ＥＳ细胞方面应用的报道尚未见到。本研究用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,从ｐｓｖ－β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ中得到３．７Ｋｂ的ｌａｃＺ基因片断,将其插入到ｐＩＮＣ载体上（Ｆｉｇ．１）,得到ｐＩＮＣ－ｌａｃＺ（Ｆｉｇ．２）。用ＮｏｔⅠ线性化ｐＩＮＣ－ｌａｃＺ后,电击导入ＭＥＳＰＵ－１３细胞中。ＭＥＳＰＵ－１３为本实验室从１２９／Ｔｅｒ品系小鼠的囊胚中建立的一个ＥＳ细胞系。转化细胞在含有２５０μｇ／ｍｌＧ４１８的培养基上培养两周,进行ＭＥＳＰＵ－１３细胞稳定转化子的筛选。在一次转化实验中,从１ｘ１０７个转化的ＭＥＳ     

枯草杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

以质粒Ｐｕｃ１８为载体,从枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＢ１０４基因组中克隆到一个内切葡聚糖酶基因。限制酶切分析表明重组质粒中的插入片段为３.５ｋｂ,其中各含有一个ＥｃｏＲＩ,ＨｉｎｄⅢ和ＰｖｕⅡ位点。该插入片段含有一完整的内切葡聚糖酶基因,其自身启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。当加入ｌａｃＺα基因启动子的诱导物ＩＰＴＧ后,内切葡聚糖酶表达量提高２.８倍。加入０.５％葡萄糖能抑制该基因的表达。该基因在大肠杆菌ＤＨ５αＦ′中表达的内切葡聚糖酶分布为：胞外６７.３％,胞间周质３.９％,胞内２８.８％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该插入片段来自供体菌Ｂ．ＳｕｂｔｉｌｉｓＤＢ１０４。     

人尿激酶原基因在聚球藻7002中的克隆和表达

将人尿激酶原基因连在ＰｐｓｂＡ启动子之后,再将启动子连同基因克隆入整合载体ｐＴＺ１８中。ｐＴＺ１８－８中含有一段来源于集胞藻６８０３的ｐｓｂＢ基因片段作为整合平台。将整合表达载体用直接转化的方法转聚球藻Ｓｙｎｅ－ｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ７００２中。经氨苄青霉素选前扩大培养后的转化进行ＤＮＡ斑点印迹及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹, 基因的存在及表达,菌体破碎后的上清液有较高的溶解纤维蛋白的活性,说明表     

光合细菌Rhodobacter sphaeroides glnBlacZ 融合子的构建与表达

亚克隆了Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｇｌｎＢ启动子,以ｐＭＰ２２０ 为载体构建成ｇｌｎＢｌａｃＺ融合子。将ｇｌｎＢｌａｃＺ、ｎｉｆＨｌａｃＺ、ｎｉｆＡｌａｃＺ分别导入Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ 谷氨酸合酶突变株ｇｌｔＢ－ 、ｇｌｔＤ－ 和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响。试验证明,在ｇｌｔＢＤ 突变株中ｎｉｆＨ 的表达受阻遏,ｎｉｆＡ 表达水平很低。这证明ｇｌｔ 基因的突变引起固氮酶结构基因和固氮正调节基因的转录被阻遏,而ｇｌｎＢ 基因的表达几乎不受影响。试验还测定了环境中结合态氮和有机酸等信号分子对ｇｌｎＢ 和ｎｉｆＨ 表达的影响,发现加入氨或谷氨酰胺后,ｎｉｆＨ 的表达受到明显的阻遏作用,ｇｌｎＢｌａｃＺ的β半乳糖苷酶活性虽下降３０ ％ 左右但不随结合态氮浓度升高而变化,仍维持在一个较高的水平。α酮戊二酸和丙酮酸对ｎｉｆＨ 的表达有部分去阻遏作用而对ｇｌｎＢ的表达无诱导作用     

LDL受体基因cDNA的RT－PCR分离、克隆及其在RFLP中的应用

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术分离低密度脂蛋白受体基因ｃＤＮＡ,将长为２６０５ｂｐ的ｃＤＮＡ插入质粒ｐＪＮ６,并经全序列测定证实,该序列与已报道序列相比,存在两个变异碱基,即第７５４位Ｃ→Ｔ,和１６５４位的Ｇ→Ａ,这两个变异碱基并不改变编码的氨基酸,利用ＬＤＬ受体基因ｃＤＮＡ中的ＣｌａⅠ片段作为探针,检测到ＬＤＬ受体基因上外显子８的ＳｔｕⅠ位点是个限制性片段长度多态性位点。所克隆的ｃＤＮＡ含有可译框架的全部密码,因此可作为基因表达材料。