寡糖素对红花及三七培养细胞的生理作用

三种寡糖素,即来自人参(Panax ginseng)培养细胞的人参寡糖素、红花(Carthamus tinctorius)培养细胞的红花寡糖素、黑节草(Dendrobium candidum)植物的黑节草寡糖素对红花及三七 (Panax notoginseng)的培养细胞的生长及代谢产物的含量均有显著的促进作用。寡糖素可耐高温高压(121℃、1.2bs／cm2)灭菌15分钟而不失活,其对植物培养细胞的影响与利用过滤方法灭菌的效果相似。红花寡糖素对红花悬浮培养细胞作用的适宜浓度是5-10mg/L,而在愈伤组织中为15mg/L,在三七培养细胞进入生长旺盛(培养至22天)时加入黑节草寡糖素,再培养2天后其生长即提高。黑节草寡糖素均能缩短红花及三七培养细胞生长的延缓期,提前进入对数生长期及指数生长期。并且使红花培养细胞中a-生育酚在细胞生长最活跃的指数生长期大量积累,最终增加了培养细胞及代谢产物的产率。     

诱导子人参寡糖对红花培养细胞的生理效应

从人参(Panax ginseng)培养细胞中分离纯化出不同寡糖。这些寡糖能促进红花(Car-thamus tinctorius)培养细胞的生长及提高细胞中α-生育酚的含量。其中以Ⅶ、Ⅷ、Ⅵ等三种寡糖的效果较为显著。这三种寡糖的最适浓度在愈伤组织培养(5—8 mg/L)中要比在细胞悬浮培养(1—2mg/L)中高。对Ⅶ、Ⅷ两种寡糖不同时期加入的效应进行了试验,结果发现,加入寡糖后1—3天,α-生育酚的含量即提高。在红花细胞悬浮培养过程中同时加入2mg/L 的寡糖Ⅵ和寡糖Ⅶ及1mg/L 的寡糖Ⅷ,可使红花细胞生长速率提高18.11%,α-生育酚含量比对照提高3.5倍,其产率比对照提高4.3倍。     

植醇与寡糖对红花悬浮培养细胞的生长及α-生育酚积累的效应

在红花细胞悬浮培养基中加入α-生育酚的前体植醇能显著增加α-生育酚的积累,较高浓度的植醇(50～100 ppm)能同时促进细胞的生长。在培养基中加入抗氧剂角鲨烯也能提高α-生育酚的积累。诱导因子寡糖对细胞的生长和α-生育酚含量均有提高作用,其中以寡糖F_(11)效果较佳。悬浮细胞培养基中同时加入15ppm的寡糖F_(11),75ppm的植醇和100 ppm的角鲨烯,细胞生长速率可提高23.81％,α-生育酚含量及产率分别比对照提高2.8倍和3.6倍。     

人参寡糖素对三七悬浮培养细胞生长的效应

从人参培养细胞的细胞壁中分离纯化到不同分子量的单体人参寡糖素。试验结果表明命名为人参寡糖素Ⅶ和人参寡糖素Ⅷ的两种寡糖素对三七悬浮培养细胞的生长具有明显的促进作用,其增长率分别为１９．３４％和１０．５８％,人参寡糖素Ⅶ的适宜浓度为５—１０ｍｇ／ｌ。在高浓度下（大于２５ｍｇ／ｌ）稍抑制培养细胞生长。在细胞培养２２天（指数生长期）后．加入１０ｍｇ／ｌ的人参寡糖素Ⅶ．然后再培养２天。其生长速率即提高,加入人参寡糖素Ⅷ后．缩短了三七细胞悬浮培养生长的延缓期．提前进入对数生长期和指数生长期,并在对数生长期和指数生长期作用最明显,因而最终收获时培养细胞的产率增加。     

寡糖素对红花及三七培养细胞的生理作用

三种寡糖素,即来自人参（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）培养细胞的人参寡糖素、红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）培养细胞的红花寡糖素、黑节草（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）植物的黑节草寡糖素对红花及三七（Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）的培养细胞的生长及代谢产物的含量均有显著的促进作用。寡糖素可耐高温高压（１２１℃、．ｂｓ／ｃｍ＾２）灭菌１５分钟而不失活,其对植物培养细胞的     

西洋参细胞悬浮培养中皂甙生物合成的代谢调节

七种真菌菌丝体诱导因子中,六种促进培养细胞的皂甙生物合成。尤其葡枝根霉作用更为明显,提高皂甙含量二倍。人参寡糖素是一种既能诱导皂甙生物合成,又能促进细胞生长的新型诱导因子,浓度为50mg／L寡糖素既能维持细胞较好生长又能提高皂甙含量,因而得到较高的皂甙产率。用四种条件培养液进行培养,结果均促进悬浮培养细胞的皂甙生物合成,其中丹参条件培养液使悬浮培养细胞的皂甙含量提高二倍多。加入皂甙生物合成主途径的三种前体,都不同程度地促进皂甙的生物合成,前体中以角鲨烯作用最为明显。     

高产人参寡糖素培养细胞变异克隆系的筛选

用２ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭＮＮＧ处理经过滤的人参悬浮培养细胞１小时后,细胞存活率下降显著,细胞克隆植板率只是对照组的１０．１２％。经细胞平板克隆共获得克降系１５１株,其中很多克隆系转移培养中生长缓慢,甚至不生长而死亡,经分析可供测定的克隆系生长的寡糖素含量的差异,对１１株寡糖素含量较高克隆系经连续１０代继代培养观察,选出一株稳定高产人参寡糖素优良克隆系ＰＧＭＢ－３７,其平均生长速率是０．５５８ｇＤＷＬ＾     

西洋参细胞大量培养的研究

当西洋参细胞培养在Ms培养液中,KN0₃含量提高一倍而去掉NH₄NO₃。时细胞生长速率和皂甙产量分别比在正常培养液中提高65．1％和166．2％。黑节草寡糖素和人参寡糖素均有利于西洋参细胞的生长和皂甙含量的提高,尤其能增加Rg组皂甙的含量。西洋参细胞悬浮培养以生产皂甙收获的最佳时期为培养25天以上,其合成皂甙的高峰在细胞生长的对数期稍后出现。细胞悬浮培养和发酵培养过程中均未见pH值回升的现象。pH值稳定的发酵培养和pH值任其变化的培养相比,其皂甙含量,生长速率和生物量均要高。最后对细胞的培养方式进行了比较。     

细胞培养生产人参寡糖素降低成本的途径

在人参（Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇ）细胞悬浮培养中,以无离子水代替重蒸馏水,细胞生长速率和寡糖素产率分别降低２．３％和２．９％。用白糖代替蔗糖,细胞生长速率和寡糖素产生率分别降低１．７４％和１．２３％。综合上述两方面结果,以无离子水和白糖分别替代原培养基中的重蒸馏水和蔗糖组成替代培养基,用替代培养基培养人参培养细胞,其生长速率可达０．５０９ｇＤＷ／Ｌ．ｄ．寡糖素产率可达１．４４３ｇ／Ｌ,和原培养基相     

高产人参寡糖素培养细胞克隆系的筛选

人参（ＰａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇＣ．Ａ．Ｍｅｙ．）培养细胞经细胞平板克隆,获得近３００个克隆系。克隆系在细胞生长速率和寡糖素含量及产率上均存在显著差异,且寡糖素产率和细胞生长之间有明显的相关性。经１１代连续继代培养观察及过氧化物酶同工酶谱特征分析,筛选到一株寡糖素产率高且稳定的克隆系ＰＧ－１８０,其平均生长速率是０．４９５ｇ于重／Ｌ·天,为原始株系的１．３９倍,平均寡糖素含量为１４．６９％干重,是亲本的１．６５倍,平均寡糖素产率是２．１８３ｇ／Ｌ,为原始株系的２．３２倍。比较克隆系ＰＧ－１８０和原始株系细胞悬浮培养时间进程发现,由人参培养细胞生产寡糖素的最佳细胞收获期为３周左右。     

红花愈伤组织诱导、生长及其α-生育酚的产生

通过TLC和HPLC初步分析和鉴定,证明从红花(Carthamus tinctorius)无菌苗的胚根、胚轴及子叶和花蕾中诱导出的愈伤组织均具有合成α-生育酚的能力。其中以胚轴的愈伤组织和悬浮培养细胞的生长速率及α-生育酚的含量较高,分别达到0.35、0.39克干重/升·天和0.62、2.28毫克/100克干重样品。对红花细胞生长较适宜的培养基为MC培养基。培养基中附加10％椰子汁或0.1％酪蛋白氨基酸可使细胞生长显著提高,分别达到0.45和0.41克干重/升·天。     

高产人参寡糖素培养细胞克隆系的诱变筛选

紫外辐射能显著地降低人参培养细胞单细胞克隆的植板率。当紫外辐射悬浮细胞３０ｓ后,细胞克隆的植林率是对照组的２１．４３％。细胞克隆平板培养６０ｄ,挑取克隆连续转移培养３次,共获得克隆系１２２株。对所有克隆系进行变异分析并经１０代连续继代培养,从中筛选到一株稳定的高产寡糖素克隆系ＰＧＵＡ－０８,而且它的过氧化物酶同工酶谱特征也保持稳定。克隆系ＰＧＵＡ－０８的生长速率为０．５３７ｇＤＷＬ－１ｄ－１,是亲本的１．４６倍,寡糖素含量为１７．１６％ＤＷ,是亲本的１．８１倍,寡糖素产率为２．７６４ｇ／Ｌ,是亲本的２．６２倍。     

红花细胞培养中高产α—生育酚克隆系的筛选

为了从红花(Carthamus tinctorius L.)培养细胞中筛选到具有高产α-生育酚性能的细胞变异体,利用细胞平板培养技术,利用HPLC法测定培养细胞中α-生育酚的含量,对200多个由单细胞或小细胞团发育而来的细胞克隆进行了筛选。结果发现,在细胞生长速率和α-生育酚含量上,这些克隆之间存在着显著的差异。在克隆的第一代分析过程中,发现α-生育酚含量由0—138.9μg/gDW变化;细胞生产速率由0.20—0.53gDW/1.d变化。细胞生长速率与α-生育酚含量之间无明显相关性。对一些α-生育酚含量较高的克隆进行了稳定性观察,经近20代继代培养观察后,从中筛选到一个合成α-生育酚较稳定的高产克隆系(CT-289),其α-生育酚平均含量为114.4μg/gDW,是原始株系(15.83μg/gDW)的7.2倍;其生长速率为0.424gDW/1.d,与原始株系(0.417gDW/l.d)相差不大。     

寡糖素对西洋参和人参愈伤组织培养的影响

红花、人参和黑节草寡糖素(简称CO、GO和DO)分别加入到培养基中,均能影响西洋参和人参愈伤组织生长和皂甙的合成。CO、GO和DO促进西洋参愈伤组织皂甙合成的最适浓度分别为5ppm、15ppm和10ppm,皂甙产率分别为14.89mg/flask、11.24mg/flask和14.53mg/flask,均明显高于对照(8.22mg/flash).CO、GO和DO促进人参愈伤组织皂甙合成的最适浓度分别为5ppm、20ppm和5ppm,皂甙产率分别为11.79mg/flask、11.20mg/flask和10.48mg/flask,均明显高于对照(6.65mg/flask),它们在适度浓度下对人参愈伤组织的生长均有促进作用。     

大丽轮枝菌寡糖素诱导的棉花组培细胞的过氧化物酶表达分析

将已在察氏液体培养基中培养3d的强毒性（V44)或弱毒性（V64）大丽轮枝菌接种到新鲜的相同培养基中,加入棉花黄萎病感病品种（S）或抗病品种（R）的悬浮培养细胞（或其细胞匀浆）。培养4d后收获真菌孢子,用于致萎力测定,收获菌丝体细胞壁用于制备真菌寡糖素（H,来自V44或L,来自V64）,然后用该寡糖素诱导悬浮培养的棉花细胞（S或R）,棉花细胞的过氧化物酶（POD）同工酶结果表明;（1）所有寡糖素均诱导棉花细胞产生新的过氧化物酶;（2）感病品种豫棉6号的活组培细胞S（或其细胞匀浆）显著影响真菌,用生长过程中接触该活细胞（或其细胞匀浆）的真菌所制备的寡糖素再诱导该活细胞（即S→L（H）→S）时,棉花细胞在36h的POD同工酶谱与其对照,即L（H）→S比较,酶带增减变化显著,致萎力测定结果表明感病品种的活细胞提高了病原毒性和致病力;（3）耐病（豫棉8号）或抗病品种（中棉12号）的活组培细胞R（或其细胞匀浆）对真菌的影响不同于感病品种,R→L（H）→R在36h的POD同工酶谱与L（H）→R比。酶带没有增减变化。但是在H→R或H→S中于9h和24h出现的酶带在R→H→R或R→H→S中分别提前到6h和9h,致萎力测定结果表明抗病品种细胞对病原毒性影响很小。     

寡糖素对滇紫草愈伤组织色素合成的影响

从黑节草、红花和人参中提取的寡糖素对滇紫草愈伤组织的色素合成均能起促进作用,当它们单独使用时,分别找到了它们作用于愈伤组织以生产色素的最适浓度.本研究对将来采用组织培养方法进一步工业化生产紫草素提供了依据。     

生产培养基中寡糖素对滇紫草愈伤组织培养的影响

黑节草寡糖素C-7和C-8,人参寡糖素G-7和G-8分别加入到培养基中,均能影响滇紫草愈伤组织中色素的合成。C-7、C-8、G-7和G-8加入到培养基中,促进紫草色素合成的最适浓度分别为1.5ppm、2.5ppm、2.5ppm和2.5ppm,色素浓度分别为21.39mg/gDW、22.68mg/gDW、29.46mg/gDW和36.73mg/gDW,均明显地高于对照(16.73mg/gDW)。并对寡糖素的作用机理进行了讨论。     

香豆素和寡糖素对马铃薯试管结薯的影响

本研究将生理活性物质香豆素、人参寡糖素和黑节草寡糖素分别加入含有BAP5.0mg/l、蔗糖8％的MS基本培养基中,用于诱导马铃薯试管结薯,并与加入矮壮素诱导的结薯效果作了比较。结果表明,在加入100mg/l香豆素时,试管结薯的数量与使用500mg/l矮壮素效果相近似。使用50mg/l人参寡糖素或10mg/l黑节草寡糖素时,试管结薯的数量明显超过或略超过用500mg/l矮壮素的效果。对4种处理下获得的试管薯进行了过氧化物酶的同工酶及酶活性的测定。结果表明,这4种不同的外源生长调节剂在使用浓度恰当时,所结薯块的过氧化物酶同工酶谱和过氧化物酶活性是近似的。     

NO对金丝桃悬浮细胞生长及金丝桃素生物合成的促进作用研究

一氧化氮 (NO)是近年来发现的一种新型植物信号分子。以硝普钠 (Sodiumnitroprusside ,SNP)为一氧化氮 (NO)的供体 ,研究外源NO对金丝桃悬浮细胞生长及金丝桃素生物合成的影响。试验结果表明 ,金丝桃悬浮细胞在含 0 5和 15 0mmol LSNP的培养基中培养 2 0d后 ,细胞的干重分别为对照组的 140%和50% ;细胞中金丝桃素的含量分别为对照组的 98%和210%。试验结果表明 ,低浓度SNP处理有利于金丝桃悬浮细胞生长 ,而高浓度SNP可以促进金丝桃素的合成。在细胞培养初期 (0d)加入 0.5mmol LSNP并在指数生长后期 (14d)加入15.0mmol LSNP的金丝桃悬浮细胞在培养 2.5d后 ,细胞的干重和金丝桃素的含量分别为对照组的1.4和1.8倍 ,金丝桃素的产量达15.2mg/L ,比对照高3.2倍。SNP对金丝桃悬浮细胞生长及金丝桃素含量的影响可以被NO专一性淬灭剂CPITO(2-4-carboxyphenyl-4 ,4 ,5 ,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)所抑制,说明SNP是通过其分解产物NO影响细胞生长和金丝桃素的合成。试验结果同时表明,在15.0mmol/L的SNP处理下,金丝桃悬浮细胞中的苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性显著升高,推测NO可能通过触发金丝桃悬浮细胞的防卫反应,激活了细胞中金丝桃素的生物合成途径。     

三七.人参和西洋参细胞悬浮培养的比较研究

用薄层层析对三七、人参和西洋参愈伤组织进行的初步鉴定表明,三种愈伤组织都含有皂甙和主要皂甙成分Rb_1、Rg_1,三七愈伤组织还含有一种抗癌皂甙Rh_1。对愈伤组织的生长,三七低于人参高于西洋参;对愈伤组织中总皂甙含量,三七均高于人参和西洋参。三种植物细胞悬浮培养结果类似于他们的愈伤组织培养,但生长又进一步提高。三七细胞悬浮培养中皂甙产生的时间进程几乎与生长平行,合适的收获期为培养30天。寡糖素不仅增强三七培养细胞的皂甙形成而且促进细胞生长,较合适的浓度为1.25 ppm。通过以上研究,使三七悬浮培养细胞的生长(干重增加178毫克)为最初培养愈伤组织的4倍以上,总皂甙产率高达20.6毫克,为最初培养愈伤组织的8.5倍。