生产重组蛋白的植物表达系统

作为高附加值重组蛋白生产平台,由于在成本和安全性方面的优势,植物已成为继微生物、哺乳动物等表达系统之后,获得广泛认同的极具潜力的蛋白表达系统。植物表达系统主要包括转基因植株,叶绿体转化植物,瞬时表达系统,细胞悬浮培养。综述了这些表达系统生产重组蛋白的产量和质量,尤其是各种表达系统的优缺点。     

哺乳动物细胞表达系统研究进展

目前,哺乳动物细胞已成为生产多种生物药物的首选宿主细胞。哺乳动物细胞表达系统可进行翻译后修饰,表达的重组蛋白接近人源构象,因此被大量用于治疗性重组蛋白的生产,如何建立高效的哺乳动物细胞表达系统也受到研究者们的重视。随着基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢组学研究不断深入,近几年来在优化哺乳动物表达系统方面取得了长足的进步。从高效表达载体构建、宿主细胞改造、高通量筛选、培养基优化等方面阐述哺乳动物细胞表达系统的研究进展,以期为研究者们提供一定的帮助。     

重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的影响因素

高效表达重组蛋白 ,对于生物制药意义重大。大多数药用蛋白是糖蛋白 ,中国仓鼠卵巢细胞 (Chinesehamsterovarycell,CHO)是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。影响外源蛋白在CHO细胞中表达的因素很多 ,从CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等方面对CHO高效表达加以阐述 ,同时提出存在的问题和未来的发展方向。     

重组胶原蛋白的产业发展历程和生物医学应用前景展望北大核心CSCD

重组胶原蛋白作为天然动物组织胶原的替代物具有广泛应用于生物材料、生物医学等领域的潜力。种类繁多的重组胶原蛋白类型及其衍生体在多种表达系统中可实现一定规模的产业化生产,为探索和拓展重组胶原蛋白的临床应用奠定了基础。文中简述了重组胶原蛋白的不同表达体系,如大肠杆菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物和人类细胞表达体系,重组胶原蛋白的优势及潜在的应用和局限。着重介绍了目前重组胶原蛋白生产,包括不同表达体系的构建策略和重组胶原蛋白羟基化修饰等方面的研究进展,总结了重组胶原蛋白在生物医药领域的应用及应用基础研究和应用前景展望。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

美国、欧盟和中国生物技术药物的比较

按照相同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为同种产品,而不同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为不同产品的原则,归纳总结了美国、欧盟和中国已批准上市的生物技术药物。美国FDA批准的以基因工程产品、抗体工程产品和细胞工程产品为主要代表的生物技术药物共79种(18种为大肠杆菌表达,8种为酵母表达,53种为哺乳动物细胞培养生产),其中基因重组蛋白质药物为64种。欧盟批准了49种基因重组酶、激素或细胞因子,11种基因重组治疗性抗体和5种基因重组疫苗。在欧美60％-70％的产品由哺乳动物细胞表达。中国批准了27种生物技术药物。比较了美国、欧盟和中国生物制药的特点。     

基因重组蛋白质表达和纯化——金普诺安的强项

金普诺安蛋白质工程技术（北京）有限公司是中美合资创办的以研发、生产基因重组蛋白质为主导业务的高科技公司。我们的主要业务之一是为国内外客户合同生产基因重组蛋白质。我们已经优化的基因重组蛋白质表达平台包括一大肠杆菌、毕赤酵母、悬浮昆虫细胞、悬浮哺乳动物细胞CHO和HEK 293。不论您的基因来源如何,我们都可在上述五个系统中找到合适的表达、纯化方法,     

蛋白质药物糖基化工程化改造研究进展

多种哺乳和非哺乳动物的蛋白质表达系统已成功用于重组糖蛋白药物的生产。糖基化对于生物药品的研究开发至关重要,对生物药品的药效、半衰期及抗原性等产生重要影响。糖基化工程的目的是生产组分明晰、结构均一的N-和O-连接的糖基化蛋白药物。N-糖基化改造的相关研究显示,利用哺乳动物和非哺乳动物表达系统可以表达均匀的N-聚糖重组糖蛋白。与N-糖基化改造相比, O-糖基化的改造研究尚处于起步阶段。首个糖基化工程单克隆抗体已在美国和日本获得上市批准。综述了重组蛋白表达系统的糖基化工程化改造的研究进展,包括蛋白质药物的 N-糖基化改造和O-糖基化改造的最新进展,以期为蛋白质药物的糖基化工程改造研究提供参考。     

Gproan基因重组蛋白质表达和纯化——金普诺安的强项

金普诺安蛋白质工程技术（北京）有限公司是中美合资创办的以研发、生产基因重组蛋白质为主导业务的高科技公司。我们的主要业务之一是为国内外客户合同生产基因重组蛋白质。我们已经优化的基因重组蛋白质表达平台包括一大肠杆菌、毕赤酵母、悬浮昆虫细胞、悬浮哺乳动物细胞CHO和HEK293。不论您的基因来源如何,我们都可在上述五个系统中找到合适的表达、纯化方法,使您免去组建团队、     

构建基于杆状病毒的BV-T7杂合表达体系及利用其在哺乳动物和禽类细胞中表达eGFP基因

【目的】研究重组杆状病毒BV-T7杂合表达体系能否有效转导禽类细胞并在禽类细胞中表达外源基因(eGFP),从而构建能在禽类细胞中高效稳定表达外源基因的重组杆状病毒表达系统。【方法】本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,结合T7表达系统,通过对eGFP表达水平的调控来把握噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的功能。利用两支重组杆状病毒,pFastBac-CMV-T7 RNAP重组杆状病毒为哺乳动物细胞启动子CMV调控的噬菌体T7 RNA聚合酶的cDNA;pFB-T7pro-IRES-GFP-T7ter重组杆状病毒为T7启动子控制的eGFP报告基因。将两支重组杆状病毒共同侵染哺乳动物OL(oligodendrocyte)细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞。【结果】两支重组杆状病毒利用T7启动子和T7 RNAP,在OL细胞、鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中成功表达eGFP报告基因,而且未引起细胞病变,但在鸡胚原代细胞中eGFP的表达相对弱于在OL细胞中的表达。在OL细胞中重组杆状病毒对细胞的转导效率为59.5%,在鸡胚成纤维细胞和鸡胚骨骼肌细胞中转导效率分别为23.2%和33.1%。【结论】本研究构建的基于杆状病毒、T7RNA聚合酶、T7启动子(BV-T7)杂合表达体系能够在哺乳类细胞及禽类细胞中表达T7 RNAP,并利用T7RNAP继续高效而稳定地表达外源基因。这为难于体外操作的RNA病毒提供了有效的研究方法,并对新型基因工程疫苗的研制提供了一个高效而稳定的表达载体系统。     

哺乳动物细胞中重组蛋白瞬时表达技术（TGE）的研究进展

近年来越来越多的重组蛋白,尤其是单克隆抗体,作为生物药应用于医疗。临床及实验室研究中,经常要求在短时间内生产一定量的候选蛋白供应研究需求。经典的建立稳定细胞系生产重组蛋白过程复杂冗长,而作为替代方法,瞬时基因表达技术在数周内即可生产数十至数百毫克重组蛋白,得到广泛应用。本文将总结近年来工业及学术上,在哺乳动物细胞尤其是人胚胎肾细胞（HEK293）TL中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中瞬时表达重组蛋白的一系列研究,概述瞬时表达技术在宿主细胞改造、表达载体最优化设计、瞬时转染条件等方面的研究进展,并展望其未来发展方向。     

哺乳动物细胞中重组蛋白瞬时表达技术(TGE)的研究进展

近年来越来越多的重组蛋白,尤其是单克隆抗体,作为生物药应用于医疗。临床及实验室研究中,经常要求在短时间内生产一定量的候选蛋白供应研究需求。经典的建立稳定细胞系生产重组蛋白过程复杂冗长,而作为替代方法,瞬时基因表达技术在数周内即可生产数十至数百毫克重组蛋白,得到广泛应用。本文将总结近年来工业及学术上,在哺乳动物细胞尤其是人胚胎肾细胞(HEK293)及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中瞬时表达重组蛋白的一系列研究,概述瞬时表达技术在宿主细胞改造、表达载体最优化设计、瞬时转染条件等方面的研究进展,并展望其未来发展方向。     

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展

利用哺乳动物细胞表达外源蛋白已广泛应用于生物产品的制备,哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主,且具有易被转染,遗传稳定,产物可分泌表达,并易于纯化和大规模生产等方面的优势。本文对选择载体类型,载体元件（包括启动子,增强子,选择标记等）以及在哺乳动物细胞大规模培养过程中培养环境,细胞凋亡的抑制和控制细胞增殖和基因表达的Tet-switch系统等方面的进展作一综述,以探讨提高该系统表达产量的有效方法,更好地应用于生物制品的生产。     

CHO细胞表达系统启动子

中国仓鼠卵巢（Chinese hamsters ovary,CHO）细胞是目前重组蛋白质生产的首选宿主细胞。利用CHO细胞生产重组蛋白质,启动子是启动转基因转录的关键。核心启动子是RNA聚合酶与转录起始复合物集合的部位,分为集中型和分散型两种类型。目前,CHO细胞常用的启动子为病毒启动子、异源启动子、内源性和诱导性启动子等。也可以利用合成生物学及相关的数据库,人工设计合成启动子及鉴定新型启动子。本文综述了CHO细胞常用的启动子以及人工设计的合成启动子在CHO细胞中重组蛋白质表达方面的进展,为哺乳动物细胞选择合适的启动子,保证蛋白质表达量最大化,并确保长时间表达稳定性提供参考。     

IL—2重组表达研究现状及发展趋势

IL－2对某些恶性肿瘤的显治疗作用为恶性肿瘤的生物治疗带来了希望，发展高纯度，高活性，高产量的IL－2基因工程产品也成为近年来研究的热点，本比较了大肠杆菌，酵母菌，哺乳动物细胞及昆虫细胞表达体系的优缺点和它们在IL－2重组表达中的应用，并对其发展趋势作了预测。     

CHO细胞表达系统启动子

中国仓鼠卵巢（Chinese hamsters ovary,CHO）细胞是目前重组蛋白质生产的首选宿主细胞。利用CHO细胞生产重组蛋白质,启动子是启动转基因转录的关键。核心启动子是RNA聚合酶与转录起始复合物集合的部位,分为集中型和分散型两种类型。目前,CHO细胞常用的启动子为病毒启动子、异源启动子、内源性和诱导性启动子等。也可以利用合成生物学及相关的数据库,人工设计合成启动子及鉴定新型启动子。本文综述了CHO细胞常用的启动子以及人工设计的合成启动子在CHO细胞中重组蛋白质表达方面的进展,为哺乳动物细胞选择合适的启动子,保证蛋白质表达量最大化,并确保长时间表达稳定性提供参考。     

重组杆状病毒：一种新型哺乳动物细胞基因转移载体

昆虫杆状病毒表达载体系统已广泛应用于表达重组蛋白。近年来研究显示,含有哺乳动物细胞启动子元件的重组杆状病毒可有效地转导多种哺乳动物原代和传代细胞。借助于杆状病毒载体,已成功实现了外源基因在哺乳动物细胞内的瞬时或稳定表达;而在体内,杆状病毒可被血清中的补体成份所灭活,从而抑制了转导效率,但是通过对杆状病毒进行修饰（如伪型杆状病毒）,可以抵抗补体的灭活作用。研究人员对杆状病毒转导机制进行了探索,但是至今尚未完全弄清。杆状病毒基因转移系统最大特点是,杆状病毒能在昆虫细胞内大量繁殖,而不能在哺乳动物细胞内复制,因而具有很高的生物安全性;同时,此系统还具有操作简便、插入外源基因容量大等优点,使得杆状病毒作为哺乳动物细胞的基因传递载体,具有广泛的应用前景。     

哺乳动物细胞高效表达系统研究进展

哺乳动物细胞高效表达系统是基因工程制药研究中的一个重要内容,而表达载体和宿主细胞是哺乳动物细胞表达系统的2个基本组成部分。近年来通过降低目的基因的位置效应、提高目的基因的转录和翻译水平以及目的基因的拷贝数等方面构建哺乳动物细胞高效表达载体。与此同时,研究也对宿主细胞进行了多方面的改造,使之能更好地适应工业化大规模培养的要求,从而降低细胞培养和产品纯化的成本。本就哺乳动物细胞高效表达载体的构建及宿主细胞的改造等方面的最新进展作一简述。     

杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究

研究已证实杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞,这提示了可将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。利用已构建的重组杆状病毒BacV-CMV-EGFPA,以含病毒的Sf9细胞培养上清同时孵育多种哺乳动物细胞,利用流式细胞术检测报告基因在不同细胞株中的转移效率及表达效率。共使用了20种哺乳动物细胞株,其中有12种人类组织细胞,7种小鼠组织细胞,1种猴组织细胞。实验结果显示携带CMV启动子的重组杆状病毒可有效进入多数哺乳动物细胞,其中对人、猴来源细胞的基因转移效率显著高于对鼠源细胞,对贴壁细胞的基因转移效率显著高于对悬浮细胞。同时,通过脂质体LipofectAMINE将携带有CMV启动子和EGFP基因的哺乳动物细胞表达质粒pCDNA3-1-EGFP分别转染部分特别是被认为杆状病毒进入能力较低的细胞株,结果显示CMV启动子在这些细胞中均可有效引导EGFP基因的表达,因此认为携带了CMV启动子的重组杆状病毒对不同哺乳动物细胞基因转移效率能基本反映出杆状病毒对不同种哺乳动物细胞的进入能力。通过综合比较携带CMV启动子的杆状病毒对不同种属及组织来源细胞的基因转移及表达效率,可看出杆状病毒对灵长类动物贴壁细胞的基因转移及表达效果是较好的,而对小鼠来源的细胞及悬浮培养细胞却并不十分理想,这表明将重组杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的基因转移工具,仍有其局限性,不一定对所有的细胞都合适,在应用时应予以充分考虑。     

用于重组蛋白药物生产的CHO细胞无血清培养基的研究进展

哺乳动物表达系统因其具有类似于人源化细胞的翻译后修饰方式,已经成为重组蛋白药物生产的主要表达系统.中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是生产重组蛋白的理想哺乳动物细胞宿主,目前近70％批准上市的重组蛋白药物是由CHO细胞生产的.常规细胞培养所用的培养基需要补充血清才能正常生长,但血清...