3α-羟类固醇脱氢酶的表达、纯化和酶学性质研究

从土壤中分离睾酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶（3α-HSD）基因。以质粒pET15b为载体,构建3α-HSD的原核表达系统。经IPTG诱导后,得到了具有酶活性的融合蛋白,细菌总蛋白的表达量为0.73g/L,其中融合酶蛋白占16.4%,活性达1.38×10.5U/L。利用融合蛋白N末端的Histag,经金属螯合亲和层析纯化后,得到了纯度较高的融合酶蛋白,酶蛋白的得率为68%,比活性为194.7U/mg。凝血酶切除Histag后,经质谱鉴定,重组蛋白的分子量为26.5kD,与理论推测值基本相同。25℃以雄酮为底物,以NAD+和thioNAD+为辅因子时,融合蛋白参与酶促反应的最适pH分别为10.5和9.4。37℃条件下酶促反应较快,25℃时的反应速度只有37℃时的52％,Q10（25℃～35℃）为1.7。25℃、pH105、以雄酮和各级胆汁酸为底物、NAD+为辅因子时,融合酶蛋白的动力学常数Km位于4.2～51.1μmol/L范围内。融合酶蛋白发挥催化作用并不需要金属离子的参与,而Fe3+、Fe2+、Zn2+则抑制酶活性,反应体系中加入EDTA也并不影响酶的活性。活性和纯度均较高的融合蛋白3α-HSD的获得及其生物学性质的研究,为血清总胆汁酸酶循环法测定的建立奠定了基础。     

睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

从土壤中分离睾酮假单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶（3α-hsd）基因,将扩增产物用NdeⅠ/BamHⅠ消化,切下目的基因片段克隆到质粒pET-15b中构建重组pET-15b.将重组pET-15b转化入E.coli DH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b.将重组pET-15b转化入宿主菌E.coli BL21(DE3) pLysS中,用硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达.提取细菌总蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析并测定酶活性.粗提物中酶活性高达2.45×10⁵ U/L.利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带,回收率达68%.活性和纯度均较高的目的蛋白3α-HSD的获得,为血清总胆汁酸酶循环法测定奠定了基础.     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因密码子优化

DHA和EPA对心脑血管疾病以及癌症等疾病的防治有着重要的作用,其中ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶是合成多不饱和脂肪酸DHA和EPA过程中的两个关键的去不饱和酶,由于缺乏这两种酶的基因,高等动物无法自发合成多不饱和脂肪酸,为了得到可以生产多不饱和脂肪酸的转基因动物,本研究计划将大豆的这两个去饱和脂肪酸作为目的基因,但由于不同物种之间的密码子使用具有偏爱性,会严重影响到目的基因在宿主体内的表达水平,为了解决这一问题,提高目的基因在宿主体内的表达水平,同时采用Jcat在线软件和手动替换密码子两种方法对大豆的ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因进行了优化,然后选出最优的优化方法,为后期进一步的实验提供目的基因。最后本文预测了两种优化结果的RNA二级结构和CAI、CBI、Nc值和GC含量,比较得出手动替换的结果优于在线优化的结果。     

人17β羟类固醇脱氢酶(17β-HSD)基因在家蚕系统中的表达(简报)

17β羟类固醇脱氢酶(17β-hydroxystero-id dehydrogenase,17β-HSD)能催化人体内类固醇性激素的形成和转化,例如它可以催化雌二醇与雌酮,雄烯二酮与睾酮之间的相互转化反应。人体内17β-HSD在胎盘组织含量最为丰富,催化17β-雌二醇等雌激素的生成,同时这些激素能够刺激乳腺瘤的增生。因此,如何抑制17β-HSD酶的过高活性,减少癌变发生的可能性,已成为目前这类癌症治疗的一个重要研究目标。目前,从胎盘组织中提取17β-HSD的方法,产量低,比活小,周期长,     

甘油脱氢酶基因在大肠杆菌中的密码子优化表达

[目的]利用密码子优化技术,提高甘油脱氢酶基因gldA在大肠杆菌中的表达水平.[方法]针对gldA起始密码子下游区域,优先选择AT含量最高的同义密码子,从而在不改变氨基酸序列的前提下,提高该区域的AT含量.利用大引物PCR的方法对野生型gldA-WT进行定点突变,获得优化型基因gldA-4,与pET-32a(+)连接后...     

大鼠20 α－羟类固醇脱氢酶在昆虫细胞中的表达

大鼠２０α羟类固醇脱氢酶（２０α－Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ,２０αＨＳＤ）ｃＤＮＡ片段,被插入杆状病毒（ＢａｃｕＩｏｖｉｒｕｓ）的转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃⅢ,经野生型病毒ＤＮＡ的共转染,从被转染的昆虫细胞中获得重组病毒。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析,重组病毒感染细胞有２０αＨＳＤ基因表达。感染细胞裂解液的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析,３７ｋＤ的蛋白带被２０αＨＳＤ抗体识别．体外酶活性测定发现,感染细胞裂解液中含有２０αＨＳＤ酶促活性以上结果提示,大鼠２０αＨＳＤ在杆状病毒昆虫表达系统成功地获得表达,为今后大量制备和纯化２０αＨＳＤ创造条件。     

3β-羟基类固醇脱氢酶基因的克隆表达及其性质研究

目的:构建3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)异源表达系统,进一步探究其酶学性质。方法:通过分子生物学方法克隆来源于Mycobacterium neoaurum菌株的3β-羟基类固醇基因,构建重组质粒,运用HPLC方法检测酶反应体系的产物。结果:本实验构建了表达载体pet28a-hsd。优化诱导表达条件,发现3β-HSD异源表达的最适温度为16℃~25℃,37℃时蛋白表达为包涵体。此外,同一温度下不同IPTG浓度诱导的表达结果差异不大。利用纯化后的蛋白进行酶特性的研究,结果表明在3β-HSD酶反应体系中,30℃达到较高的酶活性;pH 7.5~9.0之间,酶活力较强,pH低于7.0时,酶活性明显下降;有机助溶剂DMSO对酶反应有抑制作用;Fe~(3+)和Cu~(2+)对酶反应有抑制作用。结论:本实验探究了分枝杆菌中3β-羟基类固醇脱氢酶的相关性质,为进一步研究该酶在类固醇代谢中的功能提供基础。     

α-羟酸脱氢酶催化机制及其应用前景

简述α-羟酸脱氢酶家族中的乙醇酸氧化酶、乳酸单加氧酶、乳酸氧化酶、细胞色素氧化酶b2和扁桃酸脱氢酶等几种酶的蛋白质分子结构和催化机理,对该类酶的催化机制进行了比较,揭示α-羟酸脱氢酶蛋白质分子结构与功能之间的关系,为其在食品、医疗检测、重要的医药化工中间体的合成等方面的应用提供理论指导。     

氧化葡萄糖酸杆菌中5-葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶学性质分析

根据NCBI上的报道的基因序列设计引物,以氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)H24的基因组为模板,获得5-葡萄糖酸脱氢酶(Ga5DH)基因,将其与表达载体pET-28a连接,构建重组质粒pET-28a-Ga5DH,并转化大肠杆菌Rosetta进行表达。SDS-PAGE检测结果显示,表达蛋白的分子大小为26.5 kD,纯化后酶活达7.83 U/mg。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适pH为11。在pH 9-11的缓冲中保温8 h,酶活力仍有80%以上的残余。该酶对多种有机溶剂具有良好的耐受性。     

猴头菌UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因克隆表达及酶学性质

通过实验室前期对诱变菌株猴头菌321的多组学分析结果,获得了一个多糖合成过程中起关键作用的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因（UDP-glucose-4-epimerase,UGE）,并在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）中进行了异源表达。通过筛选最优的目的蛋白诱导表达条件后,通过镍柱亲和层析纯化后获得高纯度目的蛋白,并对目的蛋白进行了酶学性质的研究,明确了其生物学性质和动力学参数,为其开发利用提供理论参考。     

基因设计对重组蛋白表达的影响研究进展

利用异源表达系统生产重组蛋白已成为现代基因工程和生物工程研究热点和重点。但是研究者发现并非所有的基因都能在异源宿主中高效表达,除了宿主、分泌途径、启动子等因素外,基因自身的序列也蕴含了多种影响蛋白表达的因素,如密码子偏爱性,密码子对偏爱性,GC含量,mRNA二级结构,mRNA稳定性等。从基因设计的角度对影响蛋白表达的因素和方法进行了综述,尤其是对密码子优化和密码子对优化,详细讨论了与传统基因优化理念截然不同的密码子协调化及密码子对协调化等最新进展。     

杨树同义密码子用法的初步分析

杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一,已经成为林木基因工程研究的模式植物。用杨树的314个蛋白编码基因,通过对应分析和ENC-plot分析探讨了若干重要因子对杨树密码子用法的效应。从分析结果中可以看出,在影响最大的第一条向量轴上,基因的坐标位置与该基因的表达水平(CAI)极显著负相关(r=-0.94**),其次是与GC3S和基因长度极显著相关(r=0.86**和r=-0.57**),说明基因表达水平高低是影响密码子发挥作用的主要因素,基因编码区碱基组成和基因长度次之。ENC-plot分析结果也证明了这一点。相对密码子使用值(RSCU)的计算结果表明,高表达基因强烈偏好以A或T结尾的密码子,并确定了TTA和ATA等10个密码子为杨树的主要偏爱密码子。将杨树的密码子使用频率与拟南芥、水稻、大肠杆菌和人等不同模式生物种比较后发现,杨树密码子的偏爱性与同为双子叶植物的拟南芥最为相似,与人和大肠杆菌之间的差异较大。     

Purification and Characterization of Lactobacillus bulgaricus Diaphorase

γ-Isomer of 1,2,3,4,5,6-hexachlorocyclohexane (BHC) showed greater decomposition on γ or UV irradiation of five isomers of BHC in crystalline state or in 2-propanol solution. The α- and δ-isomer of BHC and known la, 2a, 3e, 4e, 5e-pentachlorocyclohexane were separated from the irradiation product of crystalline γ-BHC. Four compounds were isolated from the irradiation product of γ-BHC in 2-propanol. Two compounds were tetrachloro-cyclohexenes (C₆H₆C1₄): γ-isomer (mp 86 ~87°C) and ?-isomer (mp 99 ~ 100°C). The other two were isomers of pentachlorocyclohexane (C₆H₇C1₅). One of them (mp 78 ~ 8.5°C) was consistent with known meso-1e,2a,3a,4a,5e isomer. The molecular structure of the other (mp 75°C) established by X-ray crystal structure analysis was 1α, 2α, 3α, 4β, 5α configuration or le 2a 3e 4e 5e conformation of CI atoms. A reaction mechanism was proposed that included a radical chain reaction and chlorine atom migration.     

基于密码子优化策略的斑马鱼FOXP3A分子的原核表达及多克隆抗血清制备

目的:构建斑马鱼FOXP3A融合蛋白的原核表达系统,诱导表达并制备多克隆抗血清。方法:选取斑马鱼foxp3a基因cDNA的894 bp特异区段(s-foxp3a),对该片段进行密码子优化后构建原核表达载体pET-32a-s-foxp3a,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白并纯化,纯化后的蛋白免疫家兔,制备斑马鱼FOXP3A蛋白的多克隆抗血清,4次免疫后取血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果:在16℃经0.5 mmol/LIPTG诱导10 h的条件下,SDS-PAGE分析表明斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白以包涵体形式产生;间接ELISA检测结果显示,FOXP3A蛋白多克隆抗血清的效价在1.6×10~5以上。结论:制备了高效价的斑马鱼FOXP3A多克隆抗血清,为进一步解析斑马鱼FOXP3A蛋白的功能提供了基础工具。     

Ethanol directly increases dihydrotestosterone conversion to 5 alpha-androstan-3 beta,17 beta-diol and 5 alpha-androstan-3 alpha,17 beta-diol in rat Leydig cells

The direct effect of ethanol on dihydrotestosterone (DHT) conversion to 5 alpha-androstan-3 beta,17 beta-diol (3 beta-diol) and 5 alpha-androstan-3 alpha,17 beta-diol (3 alpha-diol) by adult rat Leydig cells was examined. Concentrations of ethanol comparable to blood levels of alcoholic men (2.2 - 65 mM) increased DHT conversion to 3 beta - and 3 alpha-diol, in direct relation to the dose of ethanol added; a 2-fold or greater stimulation was observed. Because this effect was blocked by 4-methylpyrazole or a saturating NADH concentration, these results suggest that this action is mediated by Leydig cell alcohol dehydrogenase activity. These results may have significant impact in the testis and/or other DHT sensitive tissues because ethanol may decrease the availability of the proposed active androgen.