红曲霉葡萄糖淀粉酶的研究II．进一步提纯及其性质

红曲霉(Monascus sp．) AS 3．2199的葡萄糖淀粉酶(E．C．3．2．1．3)的凝肢电泳图谱表现为5个带。过去曲经提纯得到过以带3和带4为主的制品。结晶的样品仍具有两个带。现将DEAE一纤维素柱层析的条件加以改变,即以0．01M、pH5.8的吡啶一盐酸缓冲液及NaCl浓度梯度(0—0．2M)洗脱,可以得到以带4为主的制品,经在同样条件下再层析即得到凝歧电泳均一的纯带q样品。纯酶作用的最适条件为pH4.5,温度50—55℃。耐热性较差,在55℃保温5小时后,酶活力仅存13％。酶作用于可溶性淀粉的米氏常数K。为1．05×10-4(克／毫 升)。Ag+、Fe++、8-羟基喹啉和碘乙酸对酶有抑制作用。用等电聚焦法测定出来的等电点pI为4．04(5—7℃)。紫外吸收光谱最高吸收值在282毫微米,最低吸收值在252毫微米。超离心沉降分析表现为均一样品,样品浓度为10毫克／毫升时测得的沉降?占数sw,20为5．55s,浓度0．27毫克／毫升时,测得的Sw,20为4．8S。用凝胶过滤法在Sephadcx G 100柱上测出分子量为55,000。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶的电子显微镜观察

利用戊二醛固定和醋酸双氧铀负染技术,在电子显微镜下观察了红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶。在30,000倍下,看到结晶为棒状晶体,边缘整齐。在162,000倍下,可以看到晶体内酶分子的有序排列,分子为球状,直径50A左右,未见亚单位,分子间距6A左右。对红曲霉葡萄糖淀粉酶结晶进行了选区电子衍射,出现四个衍射环,其对应的层间距d分别为6.4A、3.2A、2.1A、1.3A,也用激光光学衍射方法分析了结晶的电子显微镜照片,证实该结晶为三维空间晶体。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的研究III．葡萄糖淀粉酶两个分子型的比较

红曲霉(Monascus sp.)AS 3.3491的葡萄糖淀粉酶具有多型性,将其中主要的两个分子型F,和E4 提纯到凝胶电泳均一制品,并进行了比较研究。其氨基酸组成相似,差别最大的足丝氨酸,桕差6个残基,其次是精氨酸,差3个残基,其他氢基酸柑同或相差少于2个残基。氨基末端均为天冬氨酸和丝氨酸,羧基术端为酪鲺酸。两型酶都是糖蛋白,含糖量稍有差别,E,为7％,E4 为9％。其组成单糖以甘露糖为主,萁次是半乳糖,还有痕量的木糖和葡萄糖。两型的分子量也很接近。根据氨基酸残基计算,Sephadex G-100 凝胶过滤和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测出的数值均在54,000左右。 两型的等电点(pl)差别也很小,E3 为4.00,E4为4.10。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶肽段P_A的提纯及性质的研究

红曲霉葡萄糖淀粉酶能水解淀粉产生葡萄糖。我们已对它进行了提纯、结晶,及电子显微镜观察,并测定了它的一些基本性质。该酶的两个主要分子型E_3和E_4的肽图谱绝大部分是相同的,只有个别肽段不同。我们用胰凝乳蛋白酶水解红曲霉葡萄糖淀粉酶的两个型,两者的产物中都有一个P_A肽段,其凝胶电泳迁移率和纸层析R_f值相同。本文报道我们用垂直板型凝胶制备电泳及凝胶层析法提纯P_A肽段,并对其性质进行的研究结果。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶形成过程的研究

红曲霉(Monascus sp．)的葡萄糖淀粉酶具有多型性。比较了原始菌株AS3.978及其变异株AS3．2199及AS3.3491所产生的葡萄糖淀粉酶的凝胶电泳图谱,证实了三者所产生的主要区带E3和F4是互相对应的。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的底物特异性

红曲霉（Monascus sp.）As 3.3491的葡萄糖淀粉酶具有多型性,其中的两个主要组分 E3和 E4得到了凝胶电泳均一的样品。比较了它们的底物特异性,同时与粗酶液和未分纯的 E3+4作了比较。从酶对底物的分解限度来看,粗酶液能100%的分解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原、玉米淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糖和麦芽三糖,也能分解茁霉多糖（Pullulan）（35.8%）,潘糖（Panose6-α-葡糖基麦芽糖）（27.3%）、异麦芽糖（9.6%）、右旋糖酐（5%）、龙胆二糖（1.9%）。纯北的 E3和 E4仅能100%地分解糖原,麦芽糖和麦芽三糖,对其他底物的分解限度则有不同程度的降低,E3,E4和 E3+4之间没有明显差别,可以看出粗酶液中有能分解α-1,6-糖苷键的酶存在。各种酶样品均不能分解环状糊精（α,β和γ）,纤维二糖、龙胆二糖和（?）糖。比较了各种酶样品对不同底物包括不同平均链长的糊精的反应初速度,在用同样的百分浓度下,对麦芽糖、麦芽三糖、支链淀粉,可溶性淀粉等的反应初速度高,而对直链淀粉的反应初速度要低得多,这与它没有分枝,非还原性末端较少有关。对不同平均链长的小分子糊精的反应初速度随着链长的增加而增加。而对异麦芽糖的水解速度仅相当于麦芽糖的1%左右,E3,E4和 E3+4之间无明显的差别。用麦芽糖和可溶性淀粉为底物,比较了 E3和 E4的 Km 值和 Vmax值。两种酶对麦芽糖的Km 值均为1.38×10-1（%）,对于可溶性淀粉的 Km 值均为1.05（%）,Vmax也基本相同。E3和 E4对可溶性淀粉的水解产物均为β-葡萄糖,两种酶均能催化葡萄糖合成少量寡糖。     

红曲霉AS 3.3491葡萄糖淀粉酶形成的研究

对红曲霉AS3．3491供给易利用碳源,葡萄糖淀粉酶的形成受咀遏,cAMP可使之解阻遏。易利用碳源的迅速利用使培养液pH显著下降,实验发现各种提高培养液pH值的方法都能促进葡萄糖淀粉酶的形成。同时发现该菌株的五种类型的葡萄糖淀粉酶是随培养液pH的逐渐回升陆续形成的,且各型酶的出现都与培养液的一定pH值相关联。文中讨论了该菌株中葡萄糖淀粉酶形成的调控机制。     

影响红曲霉葡萄糖淀粉酶活力的因子

本文报道了某些化学试剂对红曲霉葡萄糖淀粉酶两个分子型E3和E4活力的影响。在试验的十六种金属离子中,Fe²⁺、Co¹⁺、Ca²⁺、Mg²⁺ 稍有激活作用(+20％),重金属离子Hg²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺ 和 Fe³⁺ 有不同程度的抑制作用(一20一40％),Ag+ 则是一个强烈的抑制剂(一80％)。     

用亲和层析法分离提纯红曲霉葡萄糖淀粉酶的不同分子型

葡萄糖淀粉酶(产生菌为红曲霉(Monascus rubiginosus Sato)AS3.3491)是多型性酶,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈三条区带,相应于AS3.2199(原使用菌株)所产生的E_3、E_4和E_5。由于这三个组分性质极为接近,提纯十分困难。我们曾用DEAE一纤维素柱层析和垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法分离得到了凝胶电泳     

红曲霉葡萄糖淀粉酶的紫外差光谱的研究

红曲霉葡萄糖淀粉酶(EC3 2．1．3)在凝胶电泳上呈现3--5个极为接近均具有酶活性的区带,测定了其中主要的两个分子型E,和E．的紫外吸收特性,它们在水,pH5．0酷酸缓冲液,pH7．0柠檬酸缓冲液中吸收光谱十分接近,吸收峰均在Z80am。 E,在水溶液中280am时8=11．3 x104,A==20．4,E．在水溶液中280rim时8=11．0×104Ai==20．0,E3和E4在0.1NNaOH中吸收均增强且峰位红移,在0.1N HCI中吸收峰略为蓝移。测定了E,和E．在pH 3．1和pH 3．6时的温度差光谱,在pH 3.1 E,和E. AA变化极小,在pH 3.6,E,比E．△A变化大,但转变温度E,和E．都在56℃左右。E,和E．酪氨酸光谱滴定行为极为接近,其pK值在11．5左右。测定了E,pH差光谱和变性差光谱,以pH 2．66为参比溶液,在pH 3.55、4.65、7.14及7．84可以见到酪氨酸和色氨酸的差吸收峰。8M尿素和6M盐酸胍均能使E,出现酪氨酸和色氢酸的负的差吸收峰。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶中糖肽结合方式的研究

红曲霉葡萄糖淀粉酶具有多型性,它的主要的两个型E3和E4都是糖蛋白。用气相色谱法测定了E3和E4中各种单糖组分。在E3中,糖残基数为：甘露糖16,半乳糖2,术糖2,阿拉伯糖2,葡萄糖l,总残基数为23;在E4中残基数为：甘露糖19,半乳糖3,木糖3,阿拉伯糖3,葡萄糖1,共29个残基。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶N-连接糖链的初步研究

 在加强了的碱性条件下对红曲霉葡萄糖淀粉酶进行β-消除反应,分离未发生消除的级分。对反应前后的样品进行糖组成及甲基化分析,证实了红曲霉葡萄糖淀粉酶上确有对β-消除有抵抗的含GlcNAc的糖链存在。     

产生葡萄糖淀粉酶的红曲霉的筛选及其发酵条件的研究

筛选出了红曲霉 AS 3．976(Monascus serorubescens)和 AS 3.978(Monascus sp.)作为液体培养生产葡萄糖淀粉酶的优良菌种,并找出了适合的培养基及培养条件。在含玉米粉3％、豆饼粉1．5％(pH 4．5)的培养基申,于30--35℃培养72小时,每毫升培养液的滤液酶活力可达260单位。酶作用的最适温度为50℃,最适pH为4.5,每克干淀粉用酶量0.5毫升,糖化32％(w／w)的浓淀粉液化液,经40小时,葡萄糖值可达99以上。     

红曲霉葡萄糖淀粉酶色氨酸残基的修饰与酶活力的关系

试验了几种蛋白质侧链修饰剂对锈色红曲霉(Monacus rubiginosus Sato)的葡萄糖淀粉酶(EC3．2．1．3)的影响,发现以N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)选择性氧化能使酶失活,预先加入酶的底物可溶性淀粉或麦芽糖对酶有保护作用,表明色氨酸残基对于该酶的活性是重要的,可能位于酶的结合部位或其附近。     

米曲霉葡萄糖淀粉酶基因glaB启动子研究概况

米曲霉表达系统与大肠杆菌表达系统和酵母表达系统相比有许多优点,目前绝大多数研究都关注如何提高米曲霉在液体发酵条件下生产蛋白质,但米曲霉在固体培养条件下生产多种蛋白的能力比在液体培养条件下强,这不仅与米曲霉在不同培养条件下的生长形态有关,还与不同代谢途径中特定基因的调控因子如启动子的特性有关。米曲霉葡萄糖淀粉酶基因glaB在固体培养条件下的表达效率明显高于其在液体培养条件下的效率,以葡萄糖淀粉酶基因glaB为例,综述了glaB启动子的研究概况,为今后更好地利用这类启动子提供参考。     

垂直板型凝胶制备电泳及其在分离红曲霉葡萄糖淀粉酶中的应用

红曲霉葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,EC3.2.1.3)可用于由淀粉生产葡萄糖。为了解决生产中的一些问题,有必要对酶的作用原理进行较深入的研究。但是,红曲霉葡萄糖淀粉酶具有多形性,在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为