大肠杆菌基因组中存在Era亲和蛋白的基因

构建了一个大肠杆菌基因组DNA λ ZAP表达文库,以Dig标记的Era为探针,从4×10⁴噬斑中筛选到一个与探针呈特异结合的噬斑,说明大肠杆菌基因组中确有Era亲和蛋白基因存在.将该噬菌体中插段DNA前800 bp的测序结果与1996年底完成的大肠杆菌基因组全序列作同源性比较,发现该插段序列位于大肠杆菌基因组的第267 section.     

Dig标记Era用于相应结合蛋白基因的钓取

Era是大肠杆菌生存繁殖必需的era基因产物,属G蛋白。作者推测它与其它G蛋白一样,有相应的结合蛋白存在。为了寻找Era结合蛋白及其基因,作者用Dig标记的Era对λZAP表达型大肠杆菌基因组DNA文库进行筛     

疫苗

编码风疹病毒El全蛋白的DNA或它的含氨基酸207一353的片段被分别插人到大肠杆菌表达载体pRIT2.这种载体允许由噬菌体λ的Pr启动子表达,在噬菌体     

用于通路(Gateway)克隆技术的植物表达载体研究进展

通路(Gateway)克隆技术是根据λ噬菌体基因组和大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发的一套分子克隆新技术.利用该技术LR反应构建目的基因的表达载体时不需要经过酶切和连接等繁琐而又费时的过程,因此,可以节省很多时间.为了扩大Gateway技术在植物基因工程领域的应用,最近有很多研究机构和研究小组开发了能用于组成型或诱导型表达目的基因、基因沉默、启动子分析、蛋白质亚细胞定位、蛋白质/蛋白质相互作用、多个DNA片段的模块化组装和DNA组片段功能验证等研究用的植物表达载体.该文对这些技术的研究进展进行了综述.     

抗菌肽P7抑制大肠杆菌的非膜作用机制北大核心CSCD

【目的】研究抗菌肽P7抑制大肠杆菌的非膜作用机制。【方法】P7与溴化乙锭竞争结合大肠杆菌基因组DNA的荧光光谱,分析P7与DNA的结合方式;流式细胞术分析P7与大肠杆菌基因组DNA结合对细菌细胞周期的影响;采用磁珠富集和PCR扩增相结合的方法分析P7特异结合的DNA序列;通过实时荧光定量PCR分析P7对大肠杆菌DNA复制和SOS损伤修复基因表达的影响;核酸染料的荧光分析研究P7对大肠杆菌DNA和RNA合成的影响。【结果】P7以嵌插的方式作用于大肠杆菌基因组DNA碱基对并形成肽-DNA复合物,使溴化乙锭-DNA复合体系的荧光强度减弱。P7可以显著增加大肠杆菌细胞周期中S期细胞数目,抑制大肠杆菌DNA复制。P7特异性结合rnh A使该基因表达水平显著下调2.24倍。同时,在肽的影响下参与大肠杆菌DNA复制相关的ssb、dna G、lig B和rnh A基因的表达水平显著下调(P<0.05),DNA损伤修复的rec A和rec N基因显著上调(P<0.05)。P7可降低大肠杆菌DNA和RNA的合成。【结论】P7特异性地结合rnh A序列引起大肠杆菌DNA的损伤并抑制大肠杆菌的DNA复制。在P7的影响下,参与大肠杆菌DNA复制相关的基因的表达水平下调,DNA损伤修复基因显著上调,同时抑制大肠杆菌DNA和RNA的合成。     

嗜酸氧化亚铁硫杆菌启动子探针载体的构建

目的：为了研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）启动子结构与功能。方法：以pSV-β-galactosidase质粒为骨架,通过定点突变的方法引入一个新的BstBⅠ单酶切位点,构建能在大肠杆菌（Escherichia coli）中正常复制的启动子探针载体。利用PCR的方法将A.ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段克隆到探针载体β-半乳糖苷酶基因上游以替代其原有启动子（gpt启动子）,并将重组的质粒转化E.coliDH5α菌株。通过检测宿主细胞的β-半乳糖苷酶活性,来鉴定启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。结果：pSV-β-galactosidase质粒被正确突变,成功构建了启动子探针载体pSVB。来源于A. ferrooxidans菌的启动子片段可驱动β-半乳糖苷酶基因在E.coli细胞中表达,转化子酶活性约为gpt 启动子驱动下活性的70 %。结论：启动子探针载体（pSVB）可用于A. ferrooxidans菌或者其它原核生物启动子的分离及进一步的分析研究。酶活性分析结果表明,来源于A. ferrooxidans菌cycA2基因上游5＇段上游DNA片段具有显著启动子活性。     

牛催乳素cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达

从牛垂体中分离出总的mRNA,经逆转录酶及大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA,以pBR322作为克隆载体并用加G．C尾的方法进行重组,把重组质粒导人大肠杆菌中,建立了牛垂体mRNA的cDNA文库。用标记的人工合成的牛催乳索基因片段作为探针进行杂交,并从库中筛选到几个阳性克隆,经酶谱分析和DNA序列分析证明克隆中有一个含有全长的牛催乳素cDNA序列。将所获得的克隆进行“剪切”,加上启动子,然后导人大肠杆菌JM 103中并在IPTG诱导下表达。用SDS-PAGE检测,证明有表达产物存在,再通过酶标测定证明该表达产物具有与天然牛催乳素相似的免疫学活性。     

大肠杆菌SLT-ⅡvB基因的克隆和表达

采用聚合酶链式反应(PCR),从大肠杆菌O138基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素Ⅱ型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因,定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖苷酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明:该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5′端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)细胞致弱株(JD1株)的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT-C中,获得的重组转移载体pAcHLT-C-A与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕培养细胞,获得重组病毒BacPAK-A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因,重组病毒感染家蚕5龄幼虫进行表达, ELISA和Western blotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达,表达产物具有免疫反应性,表达量在感染后5～6 d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。     

丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究

丙酮酸甲酸裂解酶（pyruvate format-lyas,PFL）是厌养或兼性厌养微生物中,代谢途径的关键酶之一,为了进一步研究其功能,我们以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板,进行PCR扩增大肠杆菌中的pfl基因,为测序方便将所得DNA片段连接到pMD18-T载体上,将测序正确后的pfl基因连接到表达载体pET-22b(＋)中,重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达, 通过SDS-PAGE电泳分析,在分子量为85kDa处出现新生的蛋白条带。利用金属亲和层析对添加了6×组氨酸标签的PFL进行纯化,对PFL的酶学性质进行了研究。结果表明：此酶的最适温度为35 ℃,最适pH为7.5,米氏常数Km＝2.3mmol,Tm＝49.9℃。     

大肠杆菌不同菌株基因组DNA的多态性分析

从大肠杆菌K12菌株JM109基因组克隆了两段DNA重复序列,长度为0.9和0.6kb,分别命名为ECR-1和ECR-6。以ECR-1和ECR-6重复序列作DNA多态性分析的探针,可以鉴别大肠杆菌非常相近的菌株。表明ECR-1和ECR-6 DNA序列可用于大肠杆菌菌株的分类、流行病学和微生态学研究以及大肠杆菌各种致病菌株的临床诊断。     

琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

cosmid克隆筛选的体内同源重组法——一个含有小鼠t复合体连锁DNA顺序的cosmid克隆的分离

一个从cosmid分子克隆库中筛选特别基因顺序的遗传学方法——体内同源重组(invlvo homologous recombination)法。即使探针DNA与分子克隆库中带有与探针同源顺序的克隆发生体内重组,然后以遗传学方法进行筛选。cosmid分子克隆库构建在rec宿主细胞内,经体内包装(in vivo Packaging)成λ噬菌体颗粒,把该噬菌体颗粒转入带有探针DNA的rec~+细胞内,探针是已被克隆在与cosmid载体没有同源顺序的质粒(如PUC8或PUC9)内的。经过一段时间(1—3小时),待重组发生后,把cosmid进行体内包装。此时探针DNA连同质粒已整合入cosmid基因组内,因此它带有原为两个载体所分别带有的双重抗性——Amp~r(氨苄青霉素,PUC8或PUC9)和Kan~r(卡那霉素,cosmid)。这种双重抗性菌落可在含有这2种抗菌素的培养平皿上选出,该重组cosmid借助于λ切除酶的作用将已被整合的探针质粒重新切除,再经体内包装后,该cosmid被还原并纯化,然后可用一含有Xgal的培皿识别和选出。本文用此法以有关DNA探针从cosmid分子克隆库中分离得到含有与小鼠t复合体连锁的基因组顺序的克隆,并对该克隆作了物理图谱分析。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae) 基因启动子的分离和鉴定

用启动子探针型载体pFR109从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisisae)总DNA中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β-半乳糖萤酶基因的表达。对其中Y8片段的进一步分析结果表明：该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Y8片段再次转入供体酵母时,它仍能启动β-半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去掉Y8片段5’端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。     

竹黄菌中一个聚酮合酶基因的初步研究

目的:从竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168中扩增出一个聚酮合酶的编码基因g4 PKS,并扩增出其中一段酮基合成酶(KS)基因片段,构建表达载体p ColdⅡ-KS,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。方法:从竹黄菌Shiraia sp.SUPER-H168中提取基因组DNA和总RNA后,采用RT-PCR方法扩增获得目的片段g4 PKS,克隆至p MD18-T进行保存。以T载体为模板,利用引物KSfor/KSrev扩增KS基因片段,构建原核表达载体p ColdⅡ-KS,并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达。结果:成功获得g4 PKS基因;成功构建表达载体p ColdⅡ-KS,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了目的蛋白。结论:成功构建出了表达载体p ColdⅡ-KS,表达出目的蛋白。     

嗜水气单胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF的原核表达及分离纯化

目的:构建嗜水气单胞菌十一碳焦磷酸合成酶XreF基因的原核表达载体,转入大肠杆菌诱导表达高活性的XreF蛋白。方法:从嗜水气单胞菌中提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,构建pPROEX-HTaXreF重组载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)表达目的蛋白;用镍离子亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析分离纯化目的蛋白XreF;用分析型凝胶过滤柱检测XreF的聚集状态。结果:构建了重组载体pPROEX-HTa-XreF,测序结果与XerF基因编码序列一致;XreF蛋白在大肠杆菌中经IPTG诱导高效表达,纯化获得高浓度(17.5 mg/mL)、高纯度(96%以上)的XreF蛋白;分析型凝胶过滤结果显示,XreF在溶液中为单体,在镁离子存在的情况下为二聚体。结论:获得并纯化了在大肠杆菌中高效表达的嗜水气单胞菌XreF,镁离子可诱导XreF在溶液中由单体向二聚体转化。     

莱茵衣藻基因组文库的构建

以莱菌衣藻CC-849为材料,提取基因组DNA,利用BamHⅠ和BglⅡ对基因组DNA进行酶解,获得了可用于构建基因组文库的6-12 kb的基因组片段,并浓缩至200 ng/μL。该片段与λDNA载体连接,经噬菌体蛋白包装、侵染大肠杆菌XL1-blue后,获得了莱菌衣藻基因组文库。该文库的滴度为2.12×10~5 pfu/mL,共有转化子4.26×10~4个,插入片段的平均长度约为9kb,扩增后基因组文库滴度为9.5×10~6 pfu/mL。     

酵母甘油醛—3—磷酸脱氢酶(GPD)基因及其启动子的分离和鉴定

以大肠杆菌质粒pBR322为载体进行了野生型酿酒酵母(S.cerevisiae)的基因组克隆。以人工合成的寡聚核苷酸(3’GTGCGTACATAGATAGAGTA5’)为探针进行分子杂交,分离到的阳性克隆经限制性内切酶酶谱、southem杂交分析证实,插入序列中的2．1kb Hind Hi片段含有GPD基因。其中650bpTaq I片段的部分序列分析结果初步表明,该区域可能包含了高表达GPD基因的启动子。     

棉铃虫核多角体病毒进化保守性基因iap2基因表达载体的构建及表达

分析棉铃虫核多角体病毒基因组 ,结合GenBank中已知的序列 ,发现iap2基因位于其基因组的BamHⅠ F片段上 ,回收此片段作为模板 ,设计引物 ,通过PCR扩增得到了抗细胞凋亡基因iap2的DNA片段。将扩增产物克隆到pGEM T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到表达载体pET 2 8a上 ,构建了重组质粒pET iap2。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的DNA序列与所发表序列完全相同。含重组质粒pET iap2的大肠杆菌BL2 1 (DE3)表达了抗细胞凋亡蛋白IAP2。