《应用微生物学生物技术》：基因表达精确调控技术获进展

中国科学院天津工业生物技术研究所张学礼研究员领导的微生物代谢工程研究组通过Red重组技术,在大肠杆菌的染色体上分别构建了启动子、信使RNA稳定区和核糖体结合位点的标准化调控元件库,并精确定量了文库中每个元件的强度。该研究已经申请了一项中国专利,相关论文在线发表于Appl．Microbi01．Biotechnol．杂志。     

专利公开

用于细胞培养基工程化的功能环境学方法 申请号：201280011020．8公布号：CNl03459584A申请日：2012．01．13公布日：2013．12．     

复合螺旋藻多糖对人结肠癌HT29细胞的抑制作用

研究复合螺旋藻多糖对人结肠癌HT29细胞的抑制作用。螺旋藻多糖（PSP）与银杏叶有效成分（GBE）1：1比例复合组、1：2比例复合组和2：1比例复合组对人结肠癌HT29细胞的抑瘤率,高剂量时分别比空白对照组提高68．04％（P〈0．01）、59．88％（P〈0．01）和58．82％（P〈0．01）;中剂量时分别比空白组提高47．52％（P〈0．01）、51．98％（P〈0．01）和40．31％（P〈0．01）;低剂量时分别比空白对照组提高39．70％（P〈0．01）、29．88％（P〈0．01）和27．31％（P〈0．01）。各复合制剂组的抑瘤率都高于相对应剂量的单一成分组,PSP与GBE联合使用对抑制人结肠癌HT29细胞能产生协同增效作用。     

川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

本工作旨在研究川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞钾通道的作用,为阐明其扩张冠状动脉血管的机制提供实验依据。采用膜片钳细胞贴附式和内面向外式记录方式观察川芎嗪对猪冠状动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance Ca2+- activated potassium channels,BKCa channels)的作用,分别用蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89和蛋白激酶G (protein kinase G,PKG)抑制剂KT-5823处理细胞,再观察川芎嗪对BKCa通道作用的变化。结果表明在研究的0．73-8．07 mmol/L浓度范围,川芎嗪可以剂量依赖性地激活BKCa通道,使通道的开放概率从(0．01±0．003)增加到(0．03±0．01)-(．21± 0．18)(P<0．01,n=10),使通道平均关闭时间从(732．33±90．67)ms降低到(359．67±41．30)-(2．96±0．52)ms(P<0．01, n=10)。川芎嗪的这种激活作用在浴液游离钙离子浓度接近0 mmol/L时也存在。PKA的特异性抑制剂H-89(3 μmol/L)和 PKG的特异性抑制剂KT-5823(1 μmol/L)对川芎嗪激活BKCa通道的作用无影响。以上结果提示:川芎嗪能直接激活冠状动脉平滑肌BKCa通道,这种作用可能是川芎嗪扩张冠状动脉血管的一种重要机制。     

微量元素锌和超氧化物歧化酶对产蛋鸡影响的研究

结果表明：与对照相比,加锌Ⅱ组鸡的产蛋率高（P＜0．05）,破壳率低（P＜0．01）;加锌Ⅱ组鸡的产蛋率高（P＜0．01）,破壳率降低（P＜0．01）,蛋重增加（P＜0．05）饲料消耗减少,Ⅱ组与Ⅲ组比较,生产性无显著差异。Ⅱ组和Ⅲ组肝中GOT和GPT、血清中AKP酶活性显著增加（P＜0．01）肝中AKPⅡ组明显上升（P＜0．05）,Ⅲ组显著提高（P＜0．01）,SOD酶活性Ⅱ明显增加（P＜0．05）,Ⅲ组显著上升（P＜0．01）,Ⅱ组与Ⅲ组比较,肝中GOT和AKP存在显著差异（P＜0．01）。其它酶活性各组间无明显差异（P＜0．05）。鸡蛋中的锌含量Ⅱ和 Ⅲ组大幅度上升（P＜0．01）,Ⅲ组磷脂降低（P＜0．05）,Ⅱ组不受影响（P＜0．05）。铁和各种氨基酸含量无明显变化（P＜0．05）。肝脏、肺脏、肌肉和翅羽中的锌含量Ⅱ组和Ⅲ组显著增加（P＜0．01）能脏中的锌含量Ⅱ组明显上升（P＜0．05）,Ⅲ组显著提高（P＜0．01）,心脏、脾脏和卵巢无显著影响（P＜0．05）。     

年龄相关性白内障晶状体脂质过氧化及抗氧化能力的变化

摘要目的：观察年龄相关性白内障晶状体中脂质过氧化及抗氧化能力的变化,探讨脂质过氧化与年龄相关性白内障的关系。方法：选择2010年8月至2011年10月我院收治的年龄相关性白内障患者35例（35眼）和透明晶状体15例（15眼）作为白内障纽和对照组,测定其维生素C（VitC）、脂质过氧化物丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性的改变。结果：与对照组相比,白内障组晶状体内VitC含量和SOD酶活性均显著下降,分别降低了39．30％（P〈0．01）和63．50％（P〈0．01）,MDA含量较明显升高（P〈O．01）。Pearson相关分析显示,对照组透明晶状体中MDA含量与SOD活性、VitC含量均呈显著负相关（r=-0．858,P〈0．01;r-=．0．883,P〈0．01）,而白内障组晶状体中三者未发现明显的直线相关关系（P〉0．05）。结论：脂质过氧化参与了年龄相关性白内障的形成,SOD和VitC对晶状体氧化损伤具有一定的保护作用。     

黄花小山菊的组织培养和快速繁殖

1植物名称黄花小山菊[Dendranthema hypargyrum（Diels）Ling et Shih]。 2材料类别茎尖。 3培养条件基本培养基为MS。丛生芽诱导和增殖培养基：MS＋6-BA1mg．L^-1（单位下同）＋NAA0．01：MS＋6-BA3＋NAA0．01：MS＋6-BA5＋NAA0．01。生根培养基：1／2MS＋NAA0．01;1／2MS＋NAA0．03;1／2MS＋NAA0．05。     

孤啡肽对大鼠顶叶皮层神经元瞬时外向钾电流的抑制作用

目的：研究孤啡肽（N／OFQ）对大鼠顶叶皮层神经元瞬时外向钾电流（IA）的影响,初步探讨其作用的通道动力学机制。方法：采用全细胞膜片钳技术,观察N／OFQ对急性分离的大鼠顶叶皮层神经元IA的作用。结果：①0．1μmol／L N／OFQ使IA幅值由给药前的（5356．1±361．6）pA下降为（4113．3±312．7）pA,抑制率为23．20％±2．17％（P〈0．01,n=10）。②0．1μmol／L N／OFQ使IA的电流-电压（I-V）曲线降低（P〈0．01,n=10）。③0．1μmol／L N／OFQ使,IA激活曲线的半数激活电压（V1／2）和斜率因子（κ）分别由给药前的（-9．2±2．5）mV和（20．4±2．3）mV变为给药后的（30．6±3．7）mV（P〈0．01,n=8）和（22．6±2．1）mV（P〉0．05,n=8）。④0．1μmol／L N／OFQ使IA失活曲线的半数失活电压（V1／2）和斜率因子（κ）分别由给药前的（-64．1±3．2）mV和（21．5±2．1）mV变为给药后的（-55．9±1．9）mV（P〈0．05,n=5）和（19．6±2．2）mV（P〉0．05,n=5）。结论：N／OFQ可抑制大鼠顶叶皮层神经元IA,使其激活曲线、失活曲线均右移。     

新型蛋白酶体抑制剂YSY-01A对肿瘤细胞促血管生成作用的抑制及其机制初探

YSY-01A是一种新型蛋白酶体抑制剂,前期研究已经证实其对肿瘤细胞的增殖有抑制作用．但是它对肿瘤血管生成是否有影响尚不明确．本研究旨在探明YSY-01A阻碍肿瘤细胞促进血管生成的作用及机制．我们首先将磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)法与细胞共培养(Transwell)模型相结合,探讨YSY-01A抑制人结肠癌细胞(HT-29 cells)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的增殖促进作用;运用高内涵筛选(high content screening,HCS)法研究YSY-01A对HT-29细胞中NF-κB核转位的影响;利用Western blot法检测YSY-01A对HT-29细胞中缺氧诱导因子-1α(hypoxia- inducible factor-1α,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达调控．为了观察YSY-01A对HUVEC增殖和运动有无直接抑制作用,我们采用SRB法观察YSY-01A对HUVEC的增殖抑制作用;运用HCS法分别考察YSY-01A对HUVEC的运动抑制和细胞毒作用．结果证实,YSY-01A可以阻碍HT-29细胞对HUVEC的增殖促进作用并具有浓度依赖性．YSY-01A还可抑制HT-29细胞中NF-κB的核转位,下调HIF-1α及VEGF的表达．进一步研究证实,YSY-01A能够浓度依赖地抑制HUVECs的增殖和运动,而不伴有明显的细胞毒作用．上述结果表明,YSY-01A可以通过抑制蛋白酶体活性下调肿瘤细胞中促血管生成因子的表达,进而在血管内皮细胞中发挥抗血管生成作用．     

呼伦贝尔草原黄羊体况的初步评价

对呼伦贝尔草原地区黄羊肾脏重量和肾脏中心脂肪指数的变化进行了研究。初步评价了不同年龄－性别组黄羊以及不同季节黄羊体况的差异。发现：黄羊左肾重量大于右肾,不同年龄－性别组黄羊间肾重存在极显的差异（P＜0．01）,并且肾重与体重呈显的正相关性（P＜0．01）;黄羊肾重存在季节性差异,春季肾重大于秋、冬二季;KMFI值在不同的年龄－性别组间也呈明显的差异性（P＜0．01）,KMFI值亦与体重吴正相关性（P＜0．01）;不同的季节,黄羊KMFI值差异明显（P＜0．01）。黄羊秋季体况最好,而冬末春初则较差。     

CO2浓度升高对棉铃虫生长发育和繁殖的直接影响

利用CDCC-1型密闭式动态CO2气室,在人工饲料下研究了不同CO2浓度（750μl/L vs．370μl/L）对棉铃虫生长发育和繁殖的直接影响,以及对棉铃虫幼虫体内营养物质和酶的含量。结果表明：（1）高CO2浓度大气中生长的棉铃虫种群发育延缓,单雌产卵量增加,虫体重量减轻,内禀增长率下降,而对人工饲料的消耗量和粪便排泄量增加。与对照相比,高CO2浓度下饲养的棉铃虫幼虫的发育历期延缓了15．14％（P〈0．01）,幼虫的取食量增加了8．03％（P〈0．01）,粪便量增加了14．54％（P〈0．05）。（2）高CO2浓度可影响棉铃虫幼虫对人工饲料的利用效率。与对照相比,在750μl/L CO2饲养下棉铃虫幼虫的相对消耗率、生长效率,食物转化率和近似消化率均有所降低。（3）高CO2浓度还改变了棉铃虫幼虫体内的营养物质的含量和酶的活性。与对照比较,750μl/L CO2饲养下棉铃虫幼虫体内蛋白质和总氨基酸含量分别下降了14．16％（P〈0．01）和28．40％（P〈0．01）;超氧化物歧化酶、乙酰胆碱酯酶和淀粉酶的活性分别增加了26．43％、9．12％和40．17％,而谷胱甘肽过氧化物酶的活性则下降了20．25％（P〈0．01）。     

霞水母糖蛋白抗疲劳作用的实验研究

本文对霞水母糖蛋白的抗疲劳作用进行了研究。试验中分别以50、100、200mg／kg剂量的霞水母糖蛋白经口给予小鼠连续灌胃30d,然后分别进行小鼠负重游泳试验、血清尿素氮、肝糖原及血乳酸测定。结果显示,霞水母糖蛋白各剂量组小鼠的游泳时间明显长于对照组（P〈0．01）;各剂量组小鼠运动后血清尿素氮含量低于对照组（P〈0．05或P〈0．01）;中、高剂量组小鼠肝糖原含量均明显高于对照组（P〈0．01）;各剂量组小鼠运动后的血乳酸含量均小于对照组（P〈0．01）。从而表明,霞水母糖蛋白具有抗疲劳作用。     

两面针提取物(S-O)对小鼠镇痛、抗炎和止血作用的研究

本研究对两面针根的提取物S-O进行了镇痛、止血和抗炎药理实验,每种作用选用两种实验方法来评价。镇痛作用采用热板法和扭体法。热板法实验显示,S-O在150mg/kg剂量时,小鼠痛阈值明显提高（P〈0．01）;扭体法实验显示,S-O在150mg/kg剂量为时,对冰醋酸致痛的小鼠扭体反应次数减少了70．96％（P〈0．01）。抗炎实验采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法及腹腔染料渗出法。二甲苯致炎剂实验表明,S-O在150mg/kg剂量时,对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有明显抑制作用,抑制率为63．45％（P〈0．01）;冰醋酸所致的腹腔毛细血管通透性实验中,S-O在150mg/kg和75mg/kg两个剂量组时,对小鼠的抗炎效果分别为52．94％（P〈0．01）和52．00％（P〈0．01）。止血实验采用毛细玻璃管法和载玻片法。毛细玻璃管实验表明S-O在150mg/kg和75mg/kg两个剂量时,凝血时间明显缩短（P〈0．01）;载玻片实验表明S-O在150mg/kg剂量时,凝血时间明显缩短（P〈0．01）。总之,两面针中提取物S-O对小鼠具有显著的镇痛、止血和抗炎作用。     

姜黄素诱导Nrf2核转位对脂多糖引起库普弗细胞分泌炎症细胞因子的影响

目的：研究姜黄素诱导大鼠Kupffer细胞Nrf2核转位对脂多糖（LPS）引起的炎症细胞因子分泌的影响。方法：分别用10μM、20μM和30μM干预Kupffer细胞8h,诱导Nrf2核转位水平;将Kupffer细胞随机分为对照组、LPS组和干预组,对照组正常培养未加姜黄素和LPS,LPS组用10μg／mL的LPS加入Kupffer细胞培养液共同培养2h;干预组用30μM姜黄素干预8h后,余处理同LPS组。Western blot检测Nrf2核转位水平,分光光度法检测细胞MDA、GSH水平,ELISA法检测上清液TNF-α和IL-6,放免法检测IL-1β。结果：①姜黄素诱导Kupffer细胞Nrf2核转位,核转位水平随浓度增加而增高。②LPS组MDA水平较对照组显著升高（P〈0．01）,干预组MDA水平较LPS组显著降低（P〈0．01）,仍显著高于对照组（P〈0．01）。LPS组GSH水平较对照组显著降低（P〈0．01）,干预组GSH水平较LPS组显著升高（P〈0．01）,仍显著低于对照组（P〈0．01）。③LPS组上清液TNF-α,IL-1β和IL-6显著高于对照组（P〈0．01）,干预组均显著低于模型组（P〈0．01）,但显著高于对照组（P〈0．01）。结论：姜黄素通过诱导Kupffer细胞Nrf2核转位,降低LPS诱导的氧化应激损伤,抑制Kupffer细胞分泌炎症细胞因子。     

黄芪甲苷Ⅳ通过影响β-actin对内皮型一氧化氮合酶的调节作用

目的：研究黄芪甲苷Ⅳ（AS-Ⅳ）对体外培养脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的调节作用及可能的机制。方法：培养人脐静脉内皮细胞系EA-Hy926,用AS-Ⅳ进行干预,同时给予或不给予骨架蛋白β—actin聚合稳定剂phalloidin,用免疫共沉淀方法检测eNOS与单体8-actin结合状态的变化,用L-3H．精氨酸转化为L-SH-瓜氨酸的同位素法测定eNOS活性,I^125环-磷酸鸟苷（cGMP）放射免疫法检测细胞内cGMP水平,Westernblotting方法检测细胞中eNOS和蛋白激酶B（Akt）磷酸化水平,总蛋白水平。结果：（1）AS-IV作用10min后,细胞内单体β—actin与eNOS的结合明显增加（P〈0．05或P〈0．01）,预先给予phalloidin显著抑制了AS．IV引起的两者结合的增加（P〈0．01）。②AS—IV明显增加了eNOS活性（P〈0．05）、cGMP含量（P〈0．01）、eNOSSer-1177磷酸化水平（P〈0．01）、AktSer-473磷酸化水平（P〈0．001）,预先给予phalloidin明显降低了AS—IV引起的eNOS活性（P〈0．05）、cGMP含量（P〈0．01）和磷酸化水平的增加（P〈0．01）,但对Akt的磷酸化没有影响。结论：单体β—actin与eNOS的结合在AS-IV激活eNOS的过程中起着不可或缺作用,其主要是通过促进Akt对eNOSSer—1177的磷酸化来实现的。     

鸭副粘病毒WF01 D株F基因的测序与蛋白特性分析

用鸭副粘病毒凤阳分离株WF01 D作9～10日龄SPF鸡胚的尿囊腔接种,成功增殖了该病毒,采用一步法RT-PCR技术扩增WF01 D病毒的F基因,获得了1条长约1．7kb的特异性条带。用PCR产物直接测序。测序结果表明,扩增片段大小为1782bp,含有1个1662bp的开放性阅读框,编码554个氨基酸。核苷酸同源性分析表明：WF01 D株与国内外其他NDVF基因的同源性为84．5％～97．0％,其中与国内标准强毒株F48E9的同源性为86．6％,说明WF01 D与国内外的传统毒株有较大变异。与Taiwan95株和J株的同源性为93．6％和97．0％,说明WF01 D与Taiwan95株和J株亲缘关系较近,具有较高的相似性。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117,表明为NDV的强毒株。蛋白疏水性和抗原性分析表明与标准强毒F48E9株相比没有太大的变异。     

丹参离体微繁技术研究

以丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)离体幼茎、叶、叶柄为外植体,对其丛生芽、不定芽的诱导和增殖、生根、移栽等方面进行系统研究,探讨了有关丹参的离体快速微繁技术。试验表明：MS 6-BA1．0mg／L是诱导初代培养的芽产生丛生芽的最佳培养基,其诱导生芽率为100％,丛生芽增殖的最佳培养基为MS 6-BA1．0mg／L NAA0．01mg／L;以叶为外植体,用MS 6-BA 0．5～2．0mg／L诱导不定芽可取得较好效果,其诱导生芽率为100％,不定芽增殖的最佳培养基为MS 6-BA1．0mg／L,其增殖倍数达24倍;诱导生根较好的培养基为1／2MS 0．1mg／L IBA,移栽先水培再土培,成活率可达100％。     

肝硬化患者血清胆碱酯酶和腺苷脱氨酶联合检测的临床意义

目的：探讨血清胆碱酯酶和腺苷脱氨酶联合检测在诊断肝硬化不同病程分期的临床意义。方法：选择20例失代偿期肝硬化患者分为失代偿组,随机选取20例代偿期肝硬化患者和20例健康人群分别分为代偿组和健康组,对3组人群的血清胆碱酯酶和腺苷脱氨酶活性进行检测并比较其差异。结果：代偿组和失代偿组的CHE活性均要显著低于健康组,差异有统计学意义（t=-8．34,P〈0．01、t=12．03,P〈0．01）,失代偿组要显著低于代偿组,差异有统计学意义（t=4.07,P〈0．01）;代偿组和失代偿组ADA活性均要显著高于健康组,差异有统计学意义（t=11．19,P〈0．01、t=-17．07,P〈0．01）,失代偿组要显著高于代偿组,差异有统计学意义（t=7．38,P〈0．01）。结论：血清胆碱酯酶和腺苷脱氨酶活性随着肝硬化病程发展发生显著变化,其联合检测可以为病程发展的临床诊断提供一定的依据。     

解偶联蛋白2通过抗氧化应激反应预防酒精性心肌损害

目的：探讨解偶联蛋白2（uncouplingprotein2,UCP2）在酒精性心肌损害中的作用及其分子机制。方法：采用乙醇在体内的代谢产物乙醛作为刺激因素,将培养心肌细胞分为对照组,乙醛组和乙醛＋ucP2抑制剂京尼平组（京尼平组）,干预24小时后检测心肌细胞中超氧阴离子（superoxideanion,SOA）及一氧化氮（nitricoxide,NO）的水平,并检测UCP2的蛋白表达水平,另一组实验干预72小时后采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡率。结果：与对照组比较,乙醛组心肌细胞中SOA水平显著升高（P〈0．01）,而NO水平显著降低（P〈0．01）,且UCP2的蛋白水平也较对照组显著增加（P〈0．01）。而与乙醛组比较,京尼平组心肌细胞中SOA的水平进一步增加（P〈0．01）,NO的水平也进一步降低（P〈0．01）。与对照组比较,乙醛可诱导培养心肌细胞凋亡（P〈0．01）,而京尼平组凋亡率较乙醛组则进一步升高（P〈0．01）。结论：UCP2在酒精性心肌损害中通过调控SOA／NO的水平发挥代偿性保护作用。     

中心静脉导管胸腔内置管闭式引流并注入尿激酶治疗包裹性结核性胸膜炎

观察中心静脉导管胸腔内置管闭式引流并注入尿激酶治疗包裹性结核性胸膜炎的效果。方法:包裹性结核性胸膜炎患者40例,随机分成治疗组(20例)与对照组(20例)。治疗组中心静脉导管胸腔内置管闭式引流并注入尿激酶10万U 生理盐水20ml,对照组注射生理盐水20ml。结果:治疗组引流量增多,治疗组胸膜粘连消失15例,对照组2例(P＜0．01)。2月后B超检查,治疗组胸膜厚度(2．5±0．8)mm,对照组(9．8±1．6)mm(P＜0．01),治疗组胸廓塌陷程度5．3±1．6%,对照组11．1±2．7%。尿激酶治疗前后动脉血气分析及肺功能有显著性差异,治疗前Pao2(83±4．5),治疗后Pao2(95±6．40),(P＜0．01)治疗前TLC% (78．5±2．2)%,治疗后(87．6±1．5)%,,(P＜0．01);治疗前VC%(73．2±4．8),治疗后VC%(84．1±5．6),(P＜0．01);治疗前FVC% 78．1±2．7,治疗后FVC%(86．5±3．5)%,(P＜0．01)。结论:胸腔内注射尿激酶能治疗包裹积液,改善胸膜粘连、肥厚及肺功能。