麦迪霉素4″—O—丙酰基转移酶（mpt）基因结构的研究

对含有麦迪霉素４″－Ｏ－丙酰基转移酶（ｍｐｔ）基因的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有２１个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）的２．４ｋｂ ＤＮＡ片段为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交,将ｍｐｔ定位于一个ＥｃｏＲＩ－ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上,将该片段克隆至大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒载体ｐＷＨＭ３     

麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素链霉菌F21中的酰化特性

螺旋霉素(SP)与麦迪霉素(MD)均为16元大环内酯类抗生素,并且结构非常相似.螺旋霉素含有3个组分,其结构差异表现在16元内酯环C<,3>上的一个取代基的差异,SPⅠ组分为羟基、SPⅡ组分羟基乙酰化、APⅢ组分羟基丙酰化;麦迪霉素是以麦迪霉素A1为主要组分的多组分抗生素,麦迪霉素16元内酯环C3上连接的均为丙酰化羟基.已知这类抗生素16元内酯环C3羟基酰化是由一种称为3-O-酰基转移酶的蛋白催化完成.本研究将螺旋霉素产生菌-Streptomycesspiramyceticus F21中的螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因用Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454中的麦迪霉素3-O-酰基转移酶基因原位替换后,发现所产生的螺旋霉素仍然含有3个组分,并且螺旋霉素Ⅲ组分也不是主要组分,说明麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素产生菌-S.spiramyceticus F21中不具有16元内酯环C3羟基丙酰化特异性以及酰化高效性,也提示其在麦迪霉素产生菌中的丙酰化特异性和高效性可能与该菌株(种)的特性有关.     

麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素链霉菌F21中酰化特性

螺旋霉素(SP)与麦迪霉素(MD)均为16元环大环内酯类抗生素, 并且结构非常相似。螺旋霉素含有3个组分,其结构差异表现在16元内酯环C3上的一个取代基的差异, SP I组分为羟基、SP II组分羟基乙酰化、SP III组分羟基丙酰化; 麦迪霉素是以麦迪霉素A1为主要组分的多组分抗生素, 麦迪霉素16元内酯环C3上连接的均为丙酰化羟基。已知这类抗生素16元内酯环C3羟基酰化是由一种称为3-O-酰基转移酶的蛋白催化完成。本研究将螺旋霉素产生菌—Streptomyces spiramyceticus F21中的螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因用Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454中的麦迪霉素3-O-酰基转移酶基因原位替换后, 发现所产生的螺旋霉素仍然含有3个组分, 并且螺旋霉素III组分也不是主要组分, 说明麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素产生菌—S. spiramyceticus F21中不具有16元内酯环C3羟基丙酰化特异性以及酰化高效性, 也提示其在麦迪霉素产生菌中的丙酰化特异性和高效性可能与该菌株(种)的特性有关。     

麦迪霉素4〃酰化酶基因的克隆及在螺旋霉产生菌中的表达

从含麦迪霉素生物合成基因⑴的初级克隆pCN6C5中,发现并分离了麦迪霉素4〃酰化酶基因,与质粒载体plJ680相连,获得重组质粒p66B,在螺旋霉素产生菌中得到表达,其主要产物为4〃异戍酰螺旋霉素。以p66B DNA BamHI—BamHI2．3kb插入片段为探针,从麦迪霉素产生菌基因文库中获得了另一阳性克隆pcNlOF5,southern分子杂交确定pcNlOF5BamHI—Bamm 8．Okb为同源片段。以pwHM3及pJJ680为载体,获得重组质粒pwF5及p6F5,分子大小分别为15．2kb及13．3kb。通过DNA转化,并经分子杂交实验证明,获得含重组质粒的螺旋霉素产生菌克隆菌株。其主要产物经分离、纯化后,分析其理化性质和光谱数据,鉴定为丙酰螺旋霉素Ⅲ和Ⅱ。研究还表明,麦迪霉素基因文库中只有pcNl0F5DNA与碳霉素产生菌的4〃异戊酰化酶基因同源,提示pcN6c5克隆携带的麦迪霉素4〃酰化酶基因与pcNlOF5的4〃丙酰化酶基因及碳霉素4〃异戊酰化酶基因有一定的区别。     

螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得

螺旋霉素(SP)为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基(SPⅠ)、乙酰基(SPⅡ)和丙酰基(SPⅢ);SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法,从螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因(sspA)及其侧翼序列,共约4.3kb(其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742)。采用DNA同源双交换技术对S.spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明:原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72%、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。     

耐热链霉菌4″-O-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达

拟研究异源调控系统提高耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-异戊酰基转移酶基因(ist)表达的可能性。在麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ~8.0 kb片段,含此基因片段的变铅青链霉菌TK24 Streptomyces lividans TK24转化子可将螺旋霉素高效转化为丙酰螺旋霉素。序列分析表明此片段除包含麦迪霉素4″-O-丙酰基转移酶基因(mpt)外还存在与其连锁的两个正调控基因orf27和orf28。将这个基因簇中mpt基因的orf替换为ist基因的orf,然后与两个正调控基因或者单独一个orf27连接,将这些构建好的片段分别克隆到中等拷贝数及高拷贝数载体pKC1139和pWHM3上,再转化到S.lividans TK24中。通过测定S.lividans TK24转化子中螺旋霉素生物转化为4″-O-酰化螺旋霉素的产率来评价mpt和ist基因的表达水平。结果表明只有高拷贝载体pWHM3构建的重组质粒S.lividans TK24转化子中才能明显检测到4″-O-异戊酰螺旋霉素的产生。mpt基因的正调节系统可以提高ist基因的表达水平,含两个调节基因的转化子转化效率高于含单一调节基因的转化子。     

植物二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)研究进展

三酰甘油(TAG)是油料作物最主要的储藏脂类,二酰甘油酰基转移酶(DGAT,EC2.3.1.20)是TAG合成途径的限速酶,其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油.在植物中已发现了3种不同类型的DGAT基因,分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3.该文对近年来国内外有关植物DGAT相关基因及其蛋白分类、定位、结构及其在脂肪酸合成、种子发育与萌发、幼苗发育、叶片新陈代谢等过程中的作用等研究进展进行综述.为提高油料作物种子油含量以及特定脂肪酸积累提供理论参考.     

利用强启动功能片段提高麦迪霉素4”，-羟基丙酰化酶基因的表达

利用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mPt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt.S.lividans TK24(p.WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89.02％和58.53％。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。     

利用强启动功能片段提高麦迪霉素4”，-羟基丙酰化酶基因的表达

用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mpt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt．S．Lividans TK24(p．WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89．02％和58．53％。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S．Spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。     

4″-异戊酰基转移酶基因重组质粒构建及其异源表达

目的:通过构建重组质粒,异源表达4＂-异戊酰基转移酶基因(4＂-isovaleyltrasferase gene,ist)生产螺旋霉素.方法:在螺旋霉素的4＂位加上异戊酰基侧链从而获得基因药物必特螺旋霉素基因.结果:研究表明acyB2基因是ist的正调控基因,ist基因与acyB2基因构建的ist-acyB2共表达质粒不能在变铅青链霉菌TK24中表达.启动区点突变的回复表明770bp到780bp之间有一碱基由原来的A回复成G.结论:经测序研究后发现在ist的启动区产生了一个点突变,拟回复此突变之后重新构建新的ist-acyB2载体,可用于检测ist基因在异源宿主中的表达情况.     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR法扩增麦迪霉素产生菌酮基还原酶（MKR）基因,得到约0．8kb的DNA片段,扩增片段重组到利用依赖T7RNA聚合酶的高效表达载体pT7－7中,在大肠杆菌中表达出28．9kD的蛋白质。表达的蛋白质具有生物活性。     

中华鳖转“全鱼”生长激素基因研究

自首例快速生长转基因鱼在我围诞生以来[1],世界上很多试验室相继开展了转基因鱼研究,以期获得快速生长[2,3]、抗逆[4,5]的养殖新品系.与传统的杂交选育方法相比,转基因育种方法摆脱了物种间遗传壁垒的桎梏,基于对目的基因功能的认识和把握,定向培育优良养殖品种,大幅缩短育种周期.     

微生物菊粉酶基因结构、酶学性质与应用研究进展

综述了微生物菊粉酶基因结构、酶学性质、发酵生产与应用等方面研究的最新进展。     

从12S rRNA基因片段序列研究20种蛇的系统发生关系

本文测定了中国产蛇亚目20种蛇约800bp的mtDNA 12S rDNA基因片段序列。所测序列与楔齿蜥的同源序列一起经Clustal X1.8软件比对,共有881个位点,其中变异位点有494个。以楔齿蜥为外群,用NJ法构建了4科20种蛇的进化关系树,对这20种蛇的系统发生关系作了初步探讨。研究结果表明：所研究的4个科20种蛇分成4个支系。第一个支系包括蟒科的东方沙蟒和蟒2种蛇;第二个支系为蝰科3种蛇,即草原蝰、尖吻蝮、竹叶青组成一个单系群;眼镜蛇科的眼镜蛇和银环蛇构成第三个支系;游蛇科的13种蛇构成了第四个支系,其中灰鼠蛇、乌梢蛇和赤链蛇组成一个支系,锦蛇属的7种蛇组成一个单系群,然后它们与前一支系相聚。剩下的颈槽蛇属两种聚类后与赤链华游蛇构成一个支系,并与游蛇科其它蛇组成姐妹群。第四支系首先与第三支系眼镜蛇科聚类,第二支系蝰科构成了三、四支系眼镜蛇科和游蛇科的姐妹群,第一支系蟒科在系统树的最基部,为四个科中较原始的类群。     

野生大豆rbcS基因的克隆及结构分析

核酮糖１,５二磷酸羧化酶（Ｒｕｂｉｓｃｏ,Ｅ．Ｃ．４．１．１．３９）是光合碳代谢中的关键酶,也是植物中研究最为广泛深入的一种酶。高等植物的Ｒｕｂｉｓｃｏ大、小亚基分别由叶绿体和核基因组编码。迄今已有几十种光合生物的Ｒｕｂｉｓｃｏ大、小亚基的基因（ｒｂｃＬ、ｒｂｃＳ）结构得到阐明［１］。在高等植物中ｒｂｃＳ基因由多基因家族编码,结构较为复杂,但它同时又是一种相对保守的基因,且同一物种内各ｒｂｃＳ基因成员是协同进化的,因此ｒｂｃＳ基因适合于植物分子进化及系统分类的研究［２］。我国是栽培大豆（Ｇｌｙｃ…     

腺病毒4型E3区核苷酸序列测定及其基因结构与功能分析

本文将Ａｄ４基因组相当于７３．３－８９．２基因图谱单位的ＤＮＡ片段进行了序列测定及基因结构分析,它包括了Ａｄ４Ｅ３区全基因及该区两侧的部分序列。序列分析表明,Ａｄ４ Ｅ３区从ＴＡＴＡＡ ｂｏｘ起至该区基因结束共４７７８ｂｐ,编码１１个大于６ｋＤ的开放读码框架。对Ａｄ４ Ｅ３区ＯＲＦ分析结果表明,Ａｄ４ Ｅ３区编码的１９．３ｋ,１５ｋ,１０．４ｋ蛋白,分别与Ａｄ２ Ｅ３区的ｇｐ１９ｋ,１４．ｋ和１０     

从12S rRNA基因第三结构域序列分析探讨蜘蛛若干重要类群的亲缘关系

本文将12S rRNA基因序列分析应用于研究若干重要蜘蛛类群的系统关系,以对传统的分类研究结论进行验证和补充,并且探讨12S rRNA基因序列分析在蜘蛛系统发生研究中的适用性。根据12S rRNA基因第3结构域构建的分子系统树得出结论:1.圆网类(即妖面蛛总科与园蛛总科)并非单系;2.隙蛛与暗蛛较漏斗蛛具有更近的亲缘关系;3.壁钱和拟壁钱并不近缘;4.有筛器类蜘蛛为复系类群;5.12S rRNA基因第3结构域片段对推断近缘科属间的系统发生关系是有效的遗传标记。     

葡萄叶绿体rbcL基因的结构分析

以玫瑰香葡萄（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ Ｌ．）为材料,克隆了含有叶绿体ｒｂｃ Ｌ基因的３．１ ｋｂ Ｂａｍ ＨⅠ片段,构建了该基因的限制性酶切图谱,测定了该基因的核苷酸序列。所测的核苷酸序列总长度为２００４ ｂｐ,其中基因的编码区为１４２８ ｂｐ,编码一个含４７５ 个氨基酸的蛋白质,其分子量约为５３ ｋＤ;测定基因的５上游含启动子的部分共３５８ ｂｐ,包括－ １０ 区（ＴＡＡＡＡＴ）、－ ３５区（ＴＴＧＣＧＣ）和ＳＤ 序列（ＧＧＡＧＧ）;基因的３下游区共２１８ ｂｐ,含有３ 个转录茎环终止结构。玫瑰香葡萄ｒｂｃ Ｌ基因编码区的核苷酸序列与烟草、矮牵牛、菠菜、苜蓿、水稻和玉米之间的同源性分别为９１．５％ 、９１．４％ 、９０．２％ 、８９．８％ 、８６．３％ 和８４．５％ ;推导出的氨基酸序列的同源性分别为９２．２％ 、９１．６％ 、９２．２％ 、９３．７％ 、９３．５％ 和９０．１％ 。     

拟南芥基因转移新方法一真空渗入法的研究

以拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）生态型Ｌａｎｄｓｂｅｎｇｅｒｅｃｔａ为试材,在含有所构建的ＣａＭＶＢａｒｉ－１株系基因ＶＩ的质粒（ｐＪＯ５３０Ｂａｒｉ－１ＧＶＩ）的根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌种ＧＶ３１０１的介导下,研究了基因转移的新方法一真空渗入法。这种方法简便、快速、可靠且无需经过组织培养阶段即可获得大量转化植株。适宜的转化条件是将生长健壮,除去主苔后４－８ｄ的成株连同营养钵倒置浸入被渗入培养基稀释的农杆菌孢子悬浮液,其光密度为０．８,在吸力为１．７ｍ２／ｈ的真空泵下断续处理２ｍｉｎ／３０ｓ,置于２４ｈ连续光照下的气候室培养,待种子收获后在含有潮霉素的选择培养基选择转化植株．ＰＣＲ分析及ＥＬＩＳＡ检测,该方法的转化效果高达０．７１％。