细胞病变型牛病毒性腹泻病毒对宿主细胞自噬作用的研究

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物细胞内损伤的细胞器和长寿命蛋白通过双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用的高度保守的分解代谢过程。本研究旨在了解细胞病变型(CEP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV NM)对宿主细胞MDBK细胞自噬作用的影响。实验使用BVDV NM株感染宿主细胞MDBK,在不同时间点分别通过透射电镜观察自噬体形成、报告荧光GFP-LC3自噬底物检测以及Western blot方法鉴定细胞自噬标记物LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ和P62的表达等试验方法对自噬进行检测。结果显示,感染BVDV NM株的MDBK细胞出现了明显的细胞病变;透射电镜能观察到细胞中存在大量的双层膜结构的自噬泡;转染GFP-LC3荧光质粒后,在感染病毒的细胞内出现增多的聚集绿色荧光自噬小体;此外,随着BVDV NM株感染MDBK时间的延长可以发现LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的量逐渐增加以及P62蛋白的降解。试验表明BVDV NM株感染MDBK可以促进细胞自噬的发生。     

猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中增殖特性的研究

以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株 (CSFVC株 )为实验材料 ,研究该病毒株在原代牛睾丸细胞中增殖的基本特性与规律。找到了一株能够使用免疫荧光技术进行检测的C株猪瘟病毒 ,并对病毒滴度的测定方法进行了改进 ,发展完善了荧光斑技术 (F PFU)。使用改进的病毒滴度测定方法 ,对接毒后培养上清中病毒滴度的变化趋势进行检测。在原代牛睾丸细胞中 ,接毒后 5d ,几乎所有的细胞都可被病毒感染 ;释放到培养液中有活性的病毒粒子达到 10 5F PFU/mL以上 ,后维持在该水平。对原代细胞中细胞种类随代次增加的变化趋势进行了观察 ,并对CSFV的增殖特点及生产中出现的一收毒价不稳定、多次收获病毒等现象的机制进行探讨。并对影响猪瘟病毒增殖的因素进行了实验 ,不仅加深了对猪瘟病毒C株在原代牛睾丸细胞中增殖规律的了解 ,还为疫苗生产中猪瘟病毒产量的提高提供新的思路     

猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株在原代牛睾丸细胞中增殖特性的研究

以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株(CSFV C株)为实验材料,研究该病毒株在原代牛睾丸细胞中增殖的基本特性与规律.找到了一株能够使用免疫荧光技术进行检测的C株猪瘟病毒,并对病毒滴度的测定方法进行了改进,发展完善了荧光斑技术(F-PFU).使用改进的病毒滴度测定方法,对接毒后培养上清中病毒滴度的变化趋势进行检测.在原代牛睾丸细胞中,接毒后5d,几乎所有的细胞都可被病毒感染;释放到培养液中有活性的病毒粒子达到105F-PFU/mL以上,后维持在该水平.对原代细胞中细胞种类随代次增加的变化趋势进行了观察,并对CSFV的增殖特点及生产中出现的一收毒价不稳定、多次收获病毒等现象的机制进行探讨.并对影响猪瘟病毒增殖的因素进行了实验,不仅加深了对猪瘟病毒C株在原代牛睾丸细胞中增殖规律的了解,还为疫苗生产中猪瘟病毒产量的提高提供新的思路.     

猪细小病毒PK-15细胞适应株的培育及增殖特性

为了研究猪细小病毒不同接毒方式的增殖规律及在不同细胞的病毒含量差异。本实验利用PK-15细胞对猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)分离株进行适应性培养。针对PPV的NS1基因设计特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法。利用该方法检测PPV分离株同步和分步接毒的病毒含量,绘制一步生长曲线;同时检测PPV在HeLa、MDBK、PK-15、ST、F81、BHK-21和Marc-145细胞上的增殖特性。结果显示,PPV分离株盲传至12代产生CPE,继续传代培养10代仍能产生稳定的细胞病变,成功培育出PK-15细胞适应株。一步生长曲线显示,分步接毒的病毒含量高于同步接毒,而增殖周期短于同步接毒;PPV在不同细胞的增殖结果显示,各细胞开始出现CPE的时间依次为PK-15、ST、HeLa和MDBK,病毒含量高低依次是ST、PK-15、MDBK和HeLa,而不能在F81、BHK-21和Marc-145细胞上增殖。本实验首次利用荧光定量PCR方法成功分析PPV不同接毒方式的增殖规律及不同细胞的增殖特性,为PPV基础研究和疫苗生产提供资料。     

猪瘟病毒C株兔脾毒在SK6细胞中的增殖培养及其鉴定

猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是猪的最重要传染病之一,给养猪业造成巨大经济损失.传统疫苗C株在猪瘟防制中曾发挥了巨大作用,但由于猪瘟病毒逐渐产生变异,同时使用传统疫苗无法区分自然感染动物和免疫动物,从而使传统疫苗的应用受阻.因此十分必要研制新型猪瘟疫苗.用适宜的宿主细胞培养猪瘟传统弱毒疫苗C株,通过灵敏可靠的方法检测病毒在宿主细胞中的感染,是研究猪瘟病毒C株的一个重要基础环节.     

膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响

膜联蛋白A2是一种参与调节多种病毒增殖的重要宿主蛋白。本研究通过构建过表达膜联蛋白A2的BHKAnxa2细胞系及瞬时敲低膜联蛋白A2,探讨膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响。通过RT-PCR从BHK-21细胞中扩增膜联蛋白A2全长cDNA,测序正确后克隆入pcDNA3.1整合表达载体中;用重组载体pcDNA3.1-Anxa2转染BHK-21细胞,经G418筛选获得抗性克隆,qRT-PCR和Western blot试验证明BHKAnxa2过表达膜联蛋白A2;EMCV感染试验证明BHK-Anxa2细胞中病毒滴度高于对照组。通过siRNA降低BHK-21细胞中膜联蛋白A2表达,EMCV感染试验证明膜联蛋白A2表达下降后EMCV增殖也随之下降。以上试验结果表明鼠膜联蛋白A2表达改变可导致病毒在BHK-21细胞中的增殖发生变化,提示膜联蛋白A2与EMCV在BHK-21细胞中的增殖相关。     

应激颗粒在冠状病毒复制中的作用及机制

近年来多种冠状病毒感染后引发患者严重的呼吸道疾病,造成危害人类健康的严重公共卫生事件。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）暴发以来,大量研究使得人们对冠状病毒与宿主相互作用机制有更多的了解,其中关于病毒感染后应激颗粒的形成和抗病毒作用也做了大量研究。病毒的RNA和蛋白可以激活宿主细胞内蛋白激酶R(Protein kinase R,PKR)及其下游信号,刺激应激颗粒（Stress granules,SGs）的形成,进而降低病毒在宿主细胞内所需蛋白的翻译水平,抑制病毒复制。然而冠状病毒与宿主长期博弈过程中也衍生出对抗细胞SGs的相应机制,比如利用蛋白与SGs相互作用,来抑制SGs的形成和解聚,逃逸细胞对病毒的抑制作用,保证病毒稳定复制,其中新型冠状病毒就是典型的例子。因此SGs的诱导为抗冠状病毒可能提供一个新型治疗策略。本文对冠状病毒感染抵抗细胞应激颗粒的形成促进其解聚的分子机制进行综述。     

细胞松驰素B对牛传染性鼻气管炎病毒感染与复制的影响

体外培养的牛肾细胞,经浓度为50μg/ml的细胞松弛素B(CB)处理2小时后,牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)仍能侵入细胞,繁殖的子代病毒数量不受影响。然而当同样浓度的CB在病毒的整个繁殖期中持续存在时,病毒的繁殖即完全被抑制。说明细胞的吞噬作用至少不是这种病毒进入细胞的唯一方式,可能病毒囊膜与细胞膜的融合是病毒进入细胞的主要方式;而在侵入细胞后的病毒繁殖过程中,细胞微丝和其它对CB敏感的系统起着不可缺少的作用。降解微丝对IBRV的早期发生有明显的影响,其效应强度与CB的浓度有关。还观察到CB处理对病毒形态发生方式有明显影响。     

猪瘟病毒弱毒株感染对体外培养细胞增殖的促进作用*

猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）能在多种体外培养细胞中增殖,却不使细胞产生病变（ＣＰＥ）。使用原代细胞增殖ＣＳＦＶ弱毒疫苗。结果显示：病毒的增殖能够增加原代牛睾丸细胞的传代次数和维持时间。因此,ＣＳＦＶ疫苗一产上能够在接毒后多次收获病毒。此外,ＣＳＦＶ弱毒株还能够刺激体外培养的兔巨噬细胞增殖,使形成致密的单细胞层。使用传代细胞ＰＫ１５样殖病毒,经流式细胞术检测发现ＣＳＦＶ弱毒的增殖不仅不改变ＰＫ１５细胞的增殖     

MicroRNA调控乙型脑炎病毒复制及发病机制的研究进展

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是具有严重危害的人畜共患病病原,感染人后入侵中枢神经系统,致死或者留下永久性神经系统后遗症。JEV还可以感染猪群,造成种猪繁殖障碍,仔猪脑炎,给养猪业带来损失。MicroRNA作为一种在转录后水平发挥基因调控功能的非编码小分子RNA,参与到细胞生长、分化、凋亡和代谢等生命过程,并且在病毒感染入侵及宿主细胞的抗病毒方面起着重要的调节作用。此文综述了当前已证实的microRNA对JEV复制及发病机制的调控作用研究。了解宿主microRNA在JEV感染过程中的可能导致识别阻断JEV复制或细胞特异性调节病毒载体靶向的新机制,并提出了防控JEV的可能途径。     

Bovine trichomoniasis

Although virtually unknown in Europe since the widespread adoption of artificial insemination (AI), infection by the sexually transmitted protozoan parasite Tritrichomonas foetus (Fig. 1) results in substantial economic losses throughout the major cattle-rearing areas of the world where natural breeding is relied upon. Infection by T. foetus is increasingly recognized as a significant cause of bovine infertility. In this review, Alex Yule, Susan Skirrow and Robert BonDurant summarize the current knowledge of bovine trichomoniasis and the problems of diagnosis and control of this economically important disease.     

Bovine Adenovirus

Nine strains of an adenovirus serotype were recovered in bovine testicle cell cultures from Japanese cattle suffering with an acute febrile illness accompanied by rhinorrhea and diarrhea. The isolated virus was shown to have the physicochemical properties of the adenovirus group such as the nucleic acid type, the size and ultrastructure of the virion, and the resistance to ether and chloroform. The isolated virus produced eosinophilic intranuclear inclusion bodies characteristic of adenoviruses and the group specific antigen of adenovirus in bovine testicle cell culture. According to the results of cross-neutralization tests the isolated virus represents a serological type distinct from bovine adenovirus types 1, 2 and 3 and from the Nagano virus. The isolated virus agglutinated erythrocytes of cattle, sheep, goat, guinea pig, rat, hamster and mouse, but not those of vervet monkey, horse, goose and chicken. HI test using cattle erythrocytes corroborated the results of serological typing by neutralization tests.     

Bovine Adenovirus

Two adenovirus strains were isolated in calf testicle cell cultures from blood specimens of cattle in Japan. This is the first isolation of bovine adenovirus reported in Japan. The isolates were antigenically similar to each other and distinct from the hitherto described serotypes 1, 2 and 3 of bovine adenovirus. Unfortunately, bovine adenovirus types 4 and 5 were not available for comparison, and hence, until the matter is settled, the virus will be called “Bovine adenovirus type Nagano”. Nagano virus was identified as adenovirus on the bases of the inhibitory effect of 5-iodo-2′-deoxyuridine on virus replication, ether-resistance, effect of temperature and pH on infectivity, and fine structure of the virus particle. The virus grew and formed intranuclear inclusion bodies, a characteristic of adenovirus, in bovine testicle cells but not in bovine kidney cells. The virus agglutinated rat erythrocytes very poorly, but not sheep, goat, cattle, horse, guinea pig, hamster, chicken, and mouse cells. The virus produced adenovirus group-specific antigen in cell cultures. Sero-negative calves were readily infected with the virus by the intravenous, subcutaneous, oral or intranasal routes of inoculation. The infected animals produced antibodies and showed a mild clinical reaction comprised of rhinorrhea, diarrhea and a degree of pyrexia; low-titered viremia of short duration and leukopenia were also observed. A serologic survey indicated wide-spread dissemination of the virus among Japanese cattle, but further studies are needed to determine the etiologic significance of the virus in the natural disease in cattle.