共查询到20条相似文献,搜索用时 15 毫秒
1.
《基因组学与应用生物学》2018,(10)
桑花叶萎缩类病毒(Mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)是近些年发现的桑花叶型萎缩病的病原物,本研究利用Mfold等软件和保守序列分析了MMDVd的二级结构及其中存在的核酶,并进一步对类病毒和卫星RNA进行了聚类分析,以期解决其分类和进化地位。结果表明MMDVd的正链存在典型的锤头型核酶结构,自切割位点为AUC,负链存在有疑似发夹型核酶的二级结构,是目前发现的第四个发夹核酶。聚类分析研究中,Pospiviroidae科类病毒单独形成一分支,Avsunviroidae科PLMVd和CChMVd首先与v LTSV聚合,而本研究MMDVd首先与卫星RNA s TRSV、s ArMV聚合,结合MMDVd正负链不同于已知Avsunviroidae科的两个锤头型核酶的结构,表明MMDVd应为一个新的未分类属,对于其核酶的自切割活性及其复制机制,则需要进一步的实验研究来验证。 相似文献
2.
针对丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)的5′非编码区和部分C区的二级结构,设计并合成了四个不同的锤头型核酶(ribozyme A, ribozyme B, ribozyme C1, ribozyme C2).首先应用体外切割实验筛选出作用于HCV-RNA起始密码子上游GTA↓位点的核酶RzA有较好的活性.为初步验证核酶RzA在细胞内的切割活性,经脂质体介导,将RzA-RNA与另一携带该核酶靶基因的质粒表达载体pCl-neo-luciferase(载体中荧光素酶基因受核酶靶基因的调控)共转染HepG2细胞.通过测定荧光素酶基因的表达证实了核酶在细胞内有较好的切割活性.在此实验基础上,把RzA基因克隆至pCl-neo质粒表达载体中,再次经脂质体介导,将重组的表达载体pCl-neo-RzA与携带该核酶靶基因的质粒表达载体pCl-neo-luciferase共转染HepG2细胞,获得了更好的切割效果. 相似文献
3.
借助计算机软件分析 ,设计出能特异性切割HPV11型 6 4 4ntE2mRNA的核酶 (ribozyme) .遵循Symon′s锤头状核酶结构和GUX剪切位点原则 ,靶序列存在 32个这样的剪切位点 .通过计算机软件分析出核酶的最佳剪切位点 ,并对底物及核酶的二级结构进行预测及进行相应基因生物学功能和基因同源性分析 ,筛选出 2个锤头结构核酶 .针对这两位点设计的核酶分别命名为RZ2 777和RZ32 81.计算机分析显示 ,两核酶与底物切点两翼碱基形成锤头状结构 ,切点所在基因序列具有相对松弛的二级结构 ,位于该基因重要生物功能区内 ,是核酶的理想攻击区域 .通过基因库检索 ,在已知人类基因排除了与上述两核酶切点两翼碱基有基因同源性序列的可能性 .将两核酶用于体外剪切实验取得了良好的实验结果 ,认为借助计算机分析可帮助尽快从多个剪切位点选择出最适核酶 相似文献
4.
5.
特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定 总被引:4,自引:0,他引:4
根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。 相似文献
6.
根据锤头核酶模型,设计合成了一个以黄瓜花叶病毒(CMV) 外壳蛋白(CP) 亚基因组RNA 为底物的锤头型核酶(RZC) 。在证明它能有效切割该底物后,再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒(TMV) 移动蛋白( MP) 亚基因组RNA 的锤头型核酶(RZ1) 相互串联构成了一个双价核酶(RZ1C) 。体外结果表明,这个双价核酶能与相应的单价核酶RZ1 和RZC 一样专一而有效地切割CMVCP和TMV MPRNA。 相似文献
7.
根据锤头型核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合,37℃温育2h。结果表明,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性,但只是其中一价核酶在起作用,讨论了二价和三价核酶的应 相似文献
8.
9.
10.
特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究 总被引:6,自引:0,他引:6
根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯地病毒中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的核酶序列,以体外转录的PLRV-Ch复制酶基因负链RNA作为底物,与转录的核酶RNA共同保温,以检测核酶对底和的体外切割作用。实验结果表明,核酸疼 RNA对PLRV-Ch复制酶基因负锭RNA具有特异切割作用。 相似文献
11.
12.
专一切割苹果锈果类病毒多体自切割核酶的克隆和转录物的体外活性测定 总被引:2,自引:0,他引:2
将苹果锈果类病毒的1个14nt的靶序列连接在锤头型核酶的3′末端,构成自切割核酶。经人工合成和PCR扩增,克隆在转录载体pGEM7zf(+)的XhoⅠ-Hind Ⅲ位点。利用限制酶Xho I与SalI的连接,消失其识别位点序列,将自切割核酶片段插入到重组质粒中,经连续5次亚克隆,分别获得2、4、6、8、10和12拷贝的多体自切割核酶。在T7RNA聚合酶作用下,线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子,提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和12体自切割核酶分别对32P标记的靶ASSVd进行反式切割,核酶与靶RNA摩尔浓度比为1:1。放射自显影结果表明:多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶。我们推测多体自切割核酶在体内系统中可能具有更好的应用价值。 相似文献
13.
14.
15.
应用mfold程序对锤头状核酶(ribozyme,Rz)和大鼠细胞周期蛋白(cyclin)D1基因的二级结构进行分析,设计合成锤头状Rz基因,通过RT-PCR扩增获得大鼠细胞周期蛋白D1目的基因,将Rz基因和细胞周期蛋白D1基因分别克隆入载体pGEM-3Zf( )中,体外转录Rz基因和靶基因并进行切割实验;将Rz基因与逆转录病毒载体pLXSN重组得到Rz真核表达载体pLXSN-Rz,将其转染入HSC-T6细胞,G418筛选出阳性细胞克隆,用RT-PCR检测细胞周期蛋白D1基因的表达。结果显示:针对目的基因的832位点设计合成了Rz832,成功获得Rz832基因、细胞周期蛋白D1mRNA的体外转录载体pGEM3Zf-Rz832和pGEM3Zf-cD1,经体外转录出Rz832(105nt)及细胞周期蛋白D1mRNA(1079nt)。体外切割实验证实Rz832能够特异性切割细胞周期蛋白D1mRNA,产生1014nt和65nt的切割产物,切割效率为80%。所构建的pLXSN-Rz832经酶切电泳、PCR鉴定显示,插入的Rz832序列大小约为57bp,与预期结果相同,经测序证实Rz832序列正确。转染pLXSN-Rz832的肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSCs)细胞周期蛋白D1mRNA的表达受到明显抑制,仅为对照组的42.22%(t=-193.443,P<0.01),结果表明:Rz832能够在体外特异性切割细胞周期蛋白D1mRNA、并在HSC-T6细胞内有效抑制细胞周期蛋白D1基因的表达。 相似文献
16.
抗水稻条纹叶枯病毒核酶的设计,克隆及体外活性测定 总被引:10,自引:0,他引:10
为探索控制水稻条纹叶枯病毒(Ricestripevirus,RSV)设计合成了特异切割该病毒RNA保守区及编码病害特异性蛋白(DiseaseSpecificProtein,DSP)基因的核酶,核酶基因的长度均为40个碱基,用化学合成方法合成其正链及与其3'-末端互补的15个碱基引物,用TagDNA多聚酶合成其互补链。双链DNA直接插入克隆载体PGEM3zf(+)的Smal位点。序列测定表明,克隆得到的核酶序列与设计的核酶序列完全一致。经SP6RNA多聚酶体外转录得到核酶RNA。当核酶RNA与以同样方法转录得到的靶基因RNA混合反应,可得到预期结果相同的切割片段,表明两种核酶在体外均具有特异性切割活性。 相似文献
17.
增殖性瘢痕组织中胶原蛋白的合成显著增加从而导致胶原的过度沉积。利用核酶特异地抑制前胶原基因的表达可减少胶原蛋白的合成,为瘢痕的研究和防治提供了新的思路。为研究用核酶抑制前胶原基因表达的可能及效果,设计并构建了针对α1(I)型及α1(Ⅲ)型前胶原基因的二个单价核酶串联的二联核酶基因真核表达载体,并对其体外切割活性 进行研究。结果表明该二联核酶的切割效果明显,均能有效地切割底物,为进一步研究核酶的前胶原基因表达的抑制作用以及利用核酶防治瘢痕产生打下基础。 相似文献
18.
异柠檬酸裂解酶(ICL)是结核病病原体结核分枝杆菌(MTB)乙醛酸循环中的关键酶,可作为抗结核新型药物治疗的潜在靶点。脱氧核酶(DRz)是一类独特的、具备酶活性的单链小分子DNA。实验针对MTBICL基因mRNA片段,通过二级结构模拟预测理论上适合与不适合DRz10~23作用的位点,据此设计针对ICL基因mRNA片段两种不同位点的DRz,并在体外水平上观察两种DRz对MTBICL基因mRNA片段的切割作用,以此验证底物二级结构模拟辅助MTB脱氧核酶潜在作用靶点预测的可行性。结果显示,底物二级结构模拟能够辅助预测MTB脱氧核酶潜在作用靶点,为探讨其作为抗结核病基因药物的可能提供实验基础。 相似文献
19.
特异切割苹果锈果类病毒的核酶基因的克隆和转录物的体外活性测定 总被引:3,自引:0,他引:3
根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成和克隆了特异切割苹果锈果类病毒ASSVd正链 (194-196位点 )或负链 (89- 91位点 )RNA的 2个短臂锤头型核酶基因 :42nt的RzASSVd(+)和 40nt的RzASSVd(- )。经转录获得核酶转录物和32P标记的ASSVd正、负链转录物。将核酶与ASSVd混合 ,50℃或 37℃保温 3~ 4h ,进行 8%PAGE(含8mol L尿素 )和放射自显影分析。体外切割检测表明 :2个核酶均具有特异切割活性 ,其中RzASSVd(- )对ASSVd负链的切割活性较高 ,对ASSVd正链不起作用。RzASSVd(+)对ASSVd正链的切割活性较弱 ,对ASSVd负链亦不起作用。在此基础上 ,构建得到双价核酶基因pGEMRzASSVd(± )。 相似文献
20.
核酶对对虾白斑病毒的一个可能的早晚期基因的体 … 总被引:3,自引:0,他引:3
报道了对虾白斑杆状病毒的一个可能的早晚期基因(1197bp基因)的克隆和序列分析,并针对此基因的转录产物,用计算机软件设计了二个锤头状核酶(RZ1和RZ2)。体外切不两个核酶均能在合适条件下,对靶基因进行完全的切割。这些研究表明,有可能利用核酶对对虾杆状病毒的复制和增殖进行抑制。 相似文献