江浙蝮蛇蛇毒蛋白诱导K562细胞调亡的研究

目的：研究江浙蝮蛇蛇毒蛋白诱导K562细胞调亡。方法：通过电镜观察蛇毒蛋白作用后K562细胞的形态变化;MTT检测蛇毒蛋白对细胞增值的影响,同时应用流式细胞仪检测细胞凋亡数及其对细胞周期的影响;采用琼脂糖凝胶电泳观测凋亡片断。结果：蛇毒蛋白作用K562细胞后,能显著抑制细胞增值;LC50为4．96μg／mL,电镜可观察到凋亡形态学改变;电泳呈现典型的阶梯状条带,流式细胞仪检测到凋亡峰。结论：江浙蝮蛇蛇毒蛋白可诱导K562细胞调亡。     

K562耐药细胞的建立及相关蛋白表达改变的研究

为研究肿瘤细胞发生多药耐药后蛋白整体水平表达的改变,将K562细胞与阿霉素(ADR)共同培养,逐渐增加药物浓度,最后建立耐阿霉素的细胞K562／ADR株。MTT法检测阿霉素(ADR)、顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和长春新碱(VCR)对K562和K562／ADR细胞的半数抑制率(IC50)。利用蛋白质组学技术,通过双向凝胶电泳分离K562和K562／ADR细胞的总蛋白,银染显色,分析差异蛋白,对部分蛋白点进行胶内酶解,用基质辅助激光解析飞行时间质谱法得肽质量指纹图谱,用AutoMS-Fit软件查询NCBInr数据库鉴定蛋白质。结果表明K562细胞经ADR诱导后出现多药耐药现象,ADR、DDP、5-FU和VCR对K562／ADR细胞的IC50明显高于K562。将K562和K562／ADR的双向电泳图谱进行差异比较,初步鉴定仅在K562／ADR图谱上出现的蛋白是一些与细胞分裂、基因转录有关的蛋白质。这些蛋白的变化与耐药细胞的特性相关,可能与临床化疗的多药耐药现象有联系。     

K562耐药细胞的建立及相关蛋白表达改变的研究

为研究肿瘤细胞发生多药耐药后蛋白整体水平表达的改变,将K562细胞与阿霉素(ADR)共同培养,逐渐增加药物浓度,最后建立耐阿霉素的细胞K562/ADR株。MTT法检测阿霉素(ADR)、顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和长春新碱(VCR)对K562和K562/ADR细胞的半数抑制率(IC_(50))。利用蛋白质组学技术,通过双向凝胶电泳分离K562和K562/ADR细胞的总蛋白,银染显色,分析差异蛋白,对部分蛋白点进行胶内酶解,用基质辅助激光解析飞行时间质谱法得肽质量指纹图谱,用AutoMS-Fit软件查询NCBInr数据库鉴定蛋白质。结果表明K562细胞经ADR诱导后出现多药耐药现象,ADR、DDP、5-FU和VCR对K562/ADR细胞的IC_(50)明显高于K562。将K562和K562/ADR的双向电泳图谱进行差异比较,初步鉴定仅在K562/ADR图谱上出现的蛋白是一些与细胞分裂、基因转录有关的蛋白质。这些蛋白的变化与耐药细胞的特性相关,可能与临床化疗的多药耐药现象有联系。     

RNAi干扰Shp2基因对K562细胞增殖的抑制效应

通过RNA干扰技术沉默蛋白酪氨酸磷酸酶跏2基因,构建重纽质粒,采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）法、Westernblot、MTT法、流式细胞术（FCM）分别检测转染后K562细胞中bcr／abl融合基因、bcr／abl融合蛋白的表达水平、细胞生长增殖变化及细胞凋亡率,探索该基因的沉默表达对K562N胞的抑制作用。结果表明,该实验成功构建出能明显下调Shp2基因及其蛋白表达的重组质粒,转染K562细胞后,其bcr／abl融合基因及融合蛋白水平均明显降低、K562细胞增殖活力被抑制（P〈0．05）、细胞凋亡水平上升（P〈0．05）。与对照组相比,其差异具有统计学意义。提示,重组质粒可显著降低bcr／abl基因及蛋白的表达,抑制K562细胞的生物学效应,表明在细胞水平沉默Shp2有可能成为治疗慢性粒细胞白血病的有效靶点。     

胡桃楸提取液诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的：考察胡桃楸提取液是否具有诱导K562细胞p52蛋白及p21蛋白的作用,初步探讨胡桃楸提取液诱导K562细胞凋亡机制。方法：以Western-blot方法检测胡桃楸提取液对K562细胞p53蛋白及诱导K562细胞p53蛋白和p21蛋白的表达。     

二烯丙基二硫诱导人白血病K562 细胞凋亡及其对Bax、Bag-1 表达的影响

目的:探讨二烯丙基二硫(Diallyl disulfide)诱导白血病K562细胞凋亡的作用及其机制。方法:采用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色法观察细胞凋亡形态学变化;DNA琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯度带;RT-PCR法检测BAG-1、BAX基因的mRNA表达变化。结果:DADS可诱导K562细胞凋亡。其对K562细胞的凋亡效用与药物浓度、有明显依赖关系;DNA琼脂糖凝胶电泳示:40mg/LDADS作用K562细胞48小时后能够产生明显的梯形电泳图谱(DNA ladder):DADS作用48h后,BAX mRNA表达水平较对照组上调;BAG-1 mRNA较对照组下调(差异具有统计学意义,P<0.05)。结论:DADS能够诱导K562细胞凋亡,其凋亡机制可能与上调BAX,下调BAG-1有关。     

川芎嗪与β-榄香烯联合应用对K562/ADM细胞的生长抑制作用

目的：探讨川芎嗪与β－榄香烯联合应用对K562/ADM的生长抑制作用。方法：以耐阿霉素细胞株K562／ADM为实验模型。结果：1．两者对K562／ADM及K562细胞的IC50接近,即耐药细胞K562／ADM对两种中药制剂不具有耐药性。2．非细胞毒性剂量的川芎嗪（TMP350μg/ml)及β－榄香精（β－elemene 4.0μg/ml)可显著降低ADM对K562／ADM细胞的IC50（P＜0．01）,提高细胞对ADM的敏感性,抗药性逆转分别为2．03倍及2．18倍。3．进一步将上述两种药物联合应用,发现其对ADM的抗药性逆转为4．65倍,明显高于二者单独应用,而且也高于两者单独应用之和,并且其对升高该细胞内ADM的浓度也具有协同作用。结论：川芭嗪与β－榄香烯联合应用能够抑制K562／ADM的的生长,并且具有协同性。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除长非编码RNA SNHG16基因促进K562细胞CD235a的表达上调

为了探究敲除长非编码RNA SNHG16对人慢性髓系白血病K562细胞的影响,我们利用CRISPR/Cas9技术在K562细胞中敲除SNHG16基因,通过流式分选获得单细胞,经扩增培养、基因组PCR鉴定、测序鉴定后,获得SNHG16杂合和纯合敲除株;通过Wright-Giemsa染色、MTS检测、流式分析和qRT-PCR分别检测了SNHG16敲除后对K562细胞形态、增殖、细胞表面标志蛋白及红系分化调控因子的影响。实验结果显示,敲除SNHG16后不影响K562细胞的形态和增殖,显著促进了K562细胞表面标志蛋白CD235a和红系分化调控因子的表达水平。该研究表明,长非编码RNA SNHG16不影响K562细胞的增殖,但SNHG16对K562细胞表面标志蛋白CD235a的表达水平有一定的调控作用。     

曲古抑菌素A对慢性髓细胞白血病细胞增殖与凋亡的作用及机制研究

该文研究了去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞株K562及K562/G01增殖和凋亡的影响及机制。采用不同浓度TSA处理K562及K562/G01细胞,CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术、蛋白印迹法和DAPI染色检测细胞凋亡;蛋白印迹法检测细胞自噬相关蛋白及BCR-ABL/STAT5/c-Myc信号轴蛋白水平。结果显示,TSA显著抑制K562及K562/G01细胞的增殖;明显促进K562及K562/G01细胞的凋亡;TSA与伊马替尼(imatinib,IM)联用可更有效地杀伤CML细胞。TSA可抑制BCR-ABL/STAT5/c-Myc信号轴,降低c-Myc蛋白水平;增强CML细胞自噬,自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)可部分回复TSA引起的凋亡。综上,TSA通过抑制STAT5信号通路,降低c-Myc蛋白水平,抑制CML细胞增殖;增强CML细胞自噬,促进其凋亡。     

过表达KLF4重组质粒的构建及其在白血病K562细胞中的表达

为了构建过表达锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因的重组质粒pEGFP-KLF4,观察其在白血病K562细胞中的表达,以RT-PCR法扩增人KLF4基因,构建pEGFP-KLF4重组质粒;经酶切及测序鉴定后,将pEGFP-KLF4质粒电穿孔转染白血病K562细胞(K562/pEGFP-KLF4组),设pEGFP-C1空质粒转染K562细胞(K562/pEGFP-C1组)及空白K562细胞作为对照,荧光显微镜观察EGFP-KLF4融合蛋白的表达情况,同时用抗生素G418筛选阳性克隆并扩大培养建立稳定过表达KLF4基因的K562细胞株,随后用RT-PCR检测3组K562细胞中KLF4的m RNA表达水平。实验结果显示,pEGFP-KLF4重组质粒构建成功。该质粒转染K562细胞24 h后能观察到较高强度的绿色荧光;经G418筛选出的阳性克隆扩大培养后建立了稳定过表达KLF4基因的K562细胞株;与对照组相比,K562/pEGFP-KLF4细胞组KLF4的m RNA表达水平明显升高,其过表达率为65.71%(P0.05)。实验中构建的过表达KLF4基因的重组质粒pEGFP-KLF4能在K562细胞中高效表达,为进一步研究其在白血病中的作用奠定了基础。     

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒神经生长因子的分离纯化和特性

神经生长因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗ ｔｈ ｆａｃｔｏｒ, Ｎ Ｇ Ｆ）是第一个被发现,也是迄今为止研究得最为清楚的一种神经营养因子 利用 Ｐ Ｃ１２ 细胞生物活力测定为跟踪检测手段,分别经过 Ｃ Ｍ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ Ｌ ６ Ｂ、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５ 及 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ ｍ ｏｎｏ Ｓ层析,从３０ ｇ 江浙蝮蛇粗毒中分离纯化到２００ μｇ Ｎ Ｇ Ｆ,纯化倍数高达１０５经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 测定,该蛋白分子量为 ２６ ｋ Ｄ,由两个亚基通过二硫键交联组成二体形式等电聚焦显示其等电点为６７,与氨基酸组成分析结果相吻合 江浙蝮蛇神经生长因子的生物活力水平与小鼠２５ Ｓ Ｎ Ｇ Ｆ相当,在１～１００ μｇ／ Ｌ 的浓度范围内维持 Ｐ Ｃ１２ 细胞在无血清条件下的存活     

几种蛇毒抑菌作用的比较

本文通过平板扩散实验观察了蛇岛蝮蛇毒、长白山白眉蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒及中华眼镜蛇毒对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌作用。结果表明四种蛇毒对试验菌株均有不同程度的抑菌作用;其中白眉蝮蛇毒对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为０．６３ｍｇ／ｍｌ,对大肠杆菌为５．０ｍｇ／ｍｌ。抑菌作用与蛇毒中Ｌ—氨基酸氧化酶的活力有相关性。利用ＣＭ—ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５ＳｅｐｈｄｅｘＧ—７５一对江浙蝮蛇毒的抑菌成份进行初步的柱层析分离,从纯化的各组份看,Ｌ—氨基酸氧化酶活力高的其抑菌活性也高。     

尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A_2I的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶 Ａ２ Ｉ（ Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ） 的基因克隆至表达载体ｐ Ｂ Ｌ Ｍ Ｖ Ｌ２ , 在大肠杆菌 Ｒ Ｒ１ 中成功表达。表达产物 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ约占细菌蛋白质总量的３０ ％ , 以包含体的形式存在。纯化包含体后, 将产物变性、复性, 然后用 Ｆ Ｐ Ｌ Ｃ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ Ｔ Ｍ１２ 纯化, 产物经过 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 检测只有单一条带。对表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定。结果显示, 表达的 Ａ．ａ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２ Ｉ的酶活性同变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶 Ａ２（ Ａ Ｐ Ｌ Ａ２） 的酶活性相近, 既具有抑制血小板聚集活性也具有溶血活性。最后对磷脂酶 Ａ２（ Ｐ Ｌ Ａ２） 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2 (A .aBPLA2 )基因克隆至温敏表达载体 pBLMVL2 ,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达 .表达产物A .aBPLA2 约占细菌蛋白质总量的 2 0 % ,并以包涵体的形式存在 .纯化包涵体后 ,将产物变性、复性 ,然后用FPLCSuperoseTM12纯化 ,产物经过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带 .对纯化后的表达A .aBPLA2 进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定 .结果显示 ,表达A .aBPLA2的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A2 酶活性相近 ,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A2 的溶血活性 ,没有抑制血小板聚集活性 .最后对磷脂酶A2 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

江浙蝮蛇毒溶血毒素晶体培养及初步晶体学研究

从江浙蝮蛇中分离纯化的碱性磷脂酶Ａ２在ｐＨ９．５,０．０５ｍｍｏｌ／ＬＣＨＥＳ缓冲液中,用汽相悬滴扩散的方法,获得了适用于高分辨率Ｘ射线结构分析的单晶．经Ｘ２００Ｂ面探测器分析,表明该晶体属于正交晶系,Ｐ２Ｉ２Ｉ２Ｉ空间群,晶胞参数为ａ＝９７．１３,ｂ＝１０３．６９,ｃ＝２３．２７．并收集了一套衍射数据,独立衍射点数１２００１个,数据完整度为８６．２％,Ｒｍｅｒｇｅ为０．０４５９．最高分辨率达２．０,根据分子量与晶胞体积估算,一个不对称单位含两个分子．     

江浙蝮蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的研究Ⅰ.分离纯化和初步表征

江浙蝮蛇毒中存在有多种精氨酸酯酶,其中有多种已被纯化,本研究应用离子交换和凝胶过滤等方法,新分离纯化了一种精氨酸酯酶,命名为Agkihpin,分子量约为25．46KDa,等电点约为7．43,含235个氨基酸残基,糖蛋白染色阴性,是单链蛋白,对TAME的最适pH为8．2。     

Partial purification of an IGF-II receptor/binding protein from the erythroleukemia cell line K562

We previously reported that insulin-like growth factor II (IGF-11) stimulated clonal growth of an erythroleukemia cell line, K562, in semi-solid agar, an effect not mimicked by insulin-like growth factor I (IGF-1), as IGF-I receptors are generally not expressed in this cell line. Affinity crosslinking of intact K562 cells with ¹²⁵I-IGF-II revealed that the labeled hormone predominantly bound to a protein with a molecular weight of approximately 75 K. We report here the partial purification of the 75 K IGF-II binding protein from K562 cells. Triton X-100-solubilized K562 cells were subjected to Sephacryl-400, followed by Sephacryl-200 chromatography. Fractions of interest were collected and applied to a Sepharose-IGF-II column or an immunoaffinity column. The immuno-affinity column was prepared using an antiserum against placental membrane-derived material eluted from the Sephacryl-400 column in the elution volume, corresponding to the IGF-II binding protein from K562 cells. An affi-gel 10 affinity column, prepared with a protein A purified IgG fraction of this antiserum (antibody-29), retarded proteins showing binding specificity for IGF-II, with apparent molecular weights of 76 K, 87 K, and 70 K under reducing conditions. These protein bands were similar to the proteins retarded in the IGF-II affinity column, when evaluated by affinity crosslinking and SDS-PAGE. Fractionation of the purified material from the antibody-29 affinity column on Superose 12 revealed 6 protein peaks. Affinity crosslinking of the peak fractions from FPLC resulted in single bands with a molecular weight of 75 K under reducing conditions with variable specificity for IGF-II.     

Purification and characterization of the fibrinolytic enzyme from Agkistrodon halys halys venom

By Q-sepharose column ion-exchange chromatography, alkyl-sepharose column hydrophobic chromatography the purified fibrinogenolytic enzyme was obtained from Agkistrodon halys halys venom. It is a single peptide-chain with molecular weight about 28 kDa. It was founded that this enzyme cleaved A alpha-chain of fibrinogen, pH-optimum was determined in the range of 7.5-8.0. Its fibrinogenolytic activity was estimated 15.6 mM fibrinogen/min per mg protein; caseinolytic activity was estimated 7.5 c.u., and amidolytic activity was 0.325 mM pNA/min/mg and 0.175 mM pNA/min/mg for S2238 and S2251 respectively; K(m) was 5.6 mM. The enzyme activity was inhibited by DFP and benzamidine. These results suggest that the enzyme is serine protease. It inhibited the platelet-aggregation.     

蝮蛇毒介导小鼠急性心肌损伤及心肌组织TNF-α表达的研究

目的探讨蝮蛇毒介导小鼠心肌组织中TNF-α蛋白表达变化与不同蝮蛇毒剂量、中毒时间的关系。方法确定LD50蝮蛇毒注射剂量。将96只小鼠随机分为空白对照组、蛇毒低剂量(0.5mg/kg)组、蛇毒高剂量(1.0mg/kg)组,并按中毒时间设4水平组,即3、6、24、48h组,采集小鼠心肌标本,免疫组化检测心肌组织中TNF-α蛋白的表达情况。结果蛇毒低剂量组及蛇毒高剂量组小鼠心肌TNF-α蛋白表达明显高于空白对照组(均P0.05);而蛇毒高剂量组明显高于低剂量组(P0.05);6h组明显高于3h组(P0.05);24h组高于6h组(P0.05);48h组高于24h组(P0.05)。随着蝮蛇毒剂量的增加、中毒时间的延长,心肌TNF-α蛋白的表达越高。结论蝮蛇毒导致小鼠急性心肌损伤,TNF-α蛋白表达增高,且随着蝮蛇毒剂量的增加、中毒时间的延长,心肌TNF-α蛋白的表达越高,呈一定的时间、剂量效应趋势,提示TNF-α蛋白过度表达可能是蝮蛇毒导致小鼠急性心肌损伤的机制之一。