哺乳动物β-防御素研究进展

哺乳动物β-防御素是一类小分子的阳离子抗菌多肽。其具有独特的抗菌机制和广谱抗菌、抗病毒活性,同时还可作为免疫调节剂来激活与调节机体的免疫系统,在医药开发或是动植物抗病育种等方面都具有很好的应用前景。就哺乳动物β-防御素的分布、分子结构、生物学活性、作用机制及其应用等方面的研究作一综述。     

鱼类β-防御素的研究进展

β-防御素是一种具有六个保守的半胱氨酸位点的阳离子两亲性小分子多肽,是抗菌肽的重要成员。随着基因组学研究的不断深入,目前在鱼类中发现了20个β-防御素基因,其基因结构均是由3个外显子和2个内含子组成,并且具有广谱抗菌活性及抗病毒活性。主要从分子结构、组织分布、基因结构、生物学活性以及生物进化等方面对鱼类β-防御素的研究概况进行综述。     

重组鹅β-防御素12蛋白的原核表达及生物学特性

【目的】研究重组鹅β-防御素12蛋白的原核表达并探究其生物学特性。【方法】采用His标签蛋白原核表达系统,将鹅防御素12(Av BD12)基因亚克隆到表达载体p Pro EX-HTa上,构建重组表达质粒。将重组表达质粒转化到大肠杆菌Rosseta感受态中,用IPTG进行诱导表达,并对该重组蛋白进行纯化。进一步采用菌落计数法测定其体外抗菌活性和盐离子稳定性。【结果】经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,诱导表达的鹅Av BD12重组蛋白分子量约为12 k D,大部分以包涵体形式存在。该重组蛋白对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌均具有抗菌活性,高浓度盐离子显著抑制重组蛋白的抗菌活性。此外,该重组蛋白对鸡红细胞没有溶血活性。【结论】该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高浓度盐离子显著降低其抗菌活性,且该重组蛋白不具有溶解鸡红细胞的活性。     

分泌性中耳炎大鼠咽鼓管鼓室β-防御素的表达

目的检测大鼠β防御素(ratβ-defensin,rBD)在分泌性中耳炎大鼠咽鼓管鼓室的表达,探讨β防御素在分泌性中耳炎发病机制中的作用。方法排除中耳感染的清洁级SD大鼠48只,随机分为4组,前3组36只行颈部切口经右侧听泡注入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)溶液(1mg/mL)30μL制作分泌性中耳炎动物模型,造模后分别于第1、3、7天断头取咽鼓管鼓室黏膜;对照组12只右侧听泡注入生理盐水30μL,左侧听泡作为正常组,3d后断头取咽鼓管鼓室黏膜。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测咽鼓管鼓室rBD-1mRNA和rBD-2mRNA的表达。结果正常大鼠咽鼓管鼓室存在rBD-1和rBD-2的表达,且rBD-1的表达较rBD-2强,差异有统计学意义;造模后第1、3、7天,rBD-1表达变化不明显;rBD-2则在造模后第1、3天明显增加,差异有统计学意义,第7天渐回复到正常水平。结论在大鼠,rBD-1可能参与正常咽鼓管鼓室的防御功能,造模后rBD-2的表达增加可能与病原体入侵后的清除相关。     

细菌感染/定植诱导慢性阻塞性肺疾病患者痰β-防御素2表达

目的：初步探讨下呼吸道细菌感染/定植对慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者痰β-防御素2（BD-2）表达水平的影响。方法：36例戒烟COPD患者和30名不吸烟/戒烟对照人员纳入研究。在COPD患者的急性加重期和稳定期分别采集自然痰进行普通细菌培养（简称痰培养）,并行细胞分类计数和BD-2浓度测定;采集对照人员诱导痰行细胞分类计数和BD-2浓度测定以资对照。结果：COPD患者急性加重期和稳定期痰培养阳性比例分别为30/36和14/36。COPD患者痰细胞总数和中性粒细胞比例、淋巴细胞比例高于对照组而巨噬细胞比例低于对照组;痰菌阳性和痰菌阴性的急性加重期COPD患者痰细胞总数、巨噬细胞比例、中性粒细胞比例分别为（6.0±0.9）×106/g、（23.6±3.9）%、（66.0±5.9）%和（3.1±0.5）×106/g、（34.3±4.3）%、（55.7±4.4）%,痰菌阳性和痰菌阴性的稳定期COPD患者痰细胞总数、巨噬细胞比例、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例分别为（4.4±0.8）×106/g、（28.6±6.4）%、（64.0±7.2）%和（3.0±0.5）×106/g、（41.4±5.7）%、（45.4±5.1）%。COPD患者稳定期痰BD-2浓度[（211±98）ng/L]低于急性加重期[（300±83）ng/L]而高于对照组[（127±41）ng/L];痰菌阳性稳定期COPD患者痰BD-2浓度高于对照组而与急性加重期无统计学差异;痰菌阴性稳定期COPD患者痰BD-2浓度低于急性加重期而与对照组无统计学差异。结论：下呼吸道细菌感染/定植是COPD患者痰BD-2表达升高的重要诱导因素,也是COPD患者急性加重发作的重要原因。     

细菌感染/ 定植诱导慢性阻塞性肺疾病患者痰β- 防御素2 表达

目的:初步探讨下呼吸道细菌感染/定植对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者痰β-防御素2(BD-2)表达水平的影响。方法:36例戒烟COPD患者和30名不吸烟/戒烟对照人员纳入研究。在COPD患者的急性加重期和稳定期分别采集自然痰进行普通细菌培养(简称痰培养),并行细胞分类计数和BD-2浓度测定;采集对照人员诱导痰行细胞分类计数和BD-2浓度测定以资对照。结果:COPD患者急性加重期和稳定期痰培养阳性比例分别为30/36和14/36。COPD患者痰细胞总数和中性粒细胞比例、淋巴细胞比例高于对照组而巨噬细胞比例低于对照组;痰菌阳性和痰菌阴性的急性加重期COPD患者痰细胞总数、巨噬细胞比例、中性粒细胞比例分别为(6.0±0.9)×106/g、(23.6±3.9)%、(66.0±5.9)%和(3.1±0.5)×106/g、(34.3±4.3)%、(55.7±4.4)%,痰菌阳性和痰菌阴性的稳定期COPD患者痰细胞总数、巨噬细胞比例、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例分别为(4.4±0.8)×106/g、(28.6±6.4)%、(64.0±7.2)%和(3.0±0.5)×106/g、(41.4±5.7)%、(45.4±5.1)%。COPD患者稳定期痰BD-2浓度[(211±98)ng/L]低于急性加重期[(300±83)ng/L]而高于对照组[(127±41)ng/L];痰菌阳性稳定期COPD患者痰BD-2浓度高于对照组而与急性加重期无统计学差异;痰菌阴性稳定期COPD患者痰BD-2浓度低于急性加重期而与对照组无统计学差异。结论:下呼吸道细菌感染/定植是COPD患者痰BD-2表达升高的重要诱导因素,也是COPD患者急性加重发作的重要原因。     

荷斯坦奶牛中性粒细胞β-防御素cDNA的克隆与序列分析

为研发牛β-防御素生物制剂,防治奶牛乳腺炎。根据已发表的牛β-防御素基因序列设计一对引物。收集患乳腺炎奶牛乳静脉血液中性粒细胞,用试剂盒提取总RNA。经RT-PCR扩增牛β-防御素cDNA片段,回收纯化PCR产物,连接pMD18-T载体,转化感受态细胞JM109。在含X-Gal、Amp及IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR及双酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为189bp,含有一个完整的ORF,能编码63个氨基酸的多肽,多肽中含6个保守半胱氨酸残基。用Blast程序进行检索比较,表明扩增序列与GenBank中发表的BNBD-7编码区序列96.3%相同。结果成功克隆出奶牛β-防御素家族的成员BNBD-7基因,为重组牛β-防御素的开发奠定了基础。     

乳杆菌细胞壁成分对小鼠阴道组织β-防御素2诱导表达的影响

目的探讨乳杆菌细胞壁成分（Lactobacilluscell wall extract,LCWE）对小鼠阴道组织β-防御素2诱导表达的影响。方法将雌性ICR小鼠随机分成5组,实验组给予不同浓度的（5、20和100 mg/L）LCWE 200μL阴道接种处理;阴性对照组小鼠阴道接种生理盐水,阳性对照组小鼠阴道接种大肠埃希菌EPEC104菌液（3×109CFU/mL）,5 d后处死,取小鼠阴道组织,做阴道菌群分析评价,部分阴道组织提取总RNA,以β-actin为内参照,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测小鼠阴道组织β-防御素2表达。结果 20 mg/L和100 mg/L浓度LCWE处理后,小鼠阴道菌群较生理盐水组的肠杆菌、葡萄球菌明显减少（P〈0.05）,乳杆菌无显著性变化（P〉0.05）。生理盐水组小鼠阴道组织β-防御素2 mRNA表达量极低,大肠埃希菌阳性对照组能显著诱导小鼠阴道组织β-防御素2 mRNA的表达;5 mg/L浓度LCWE处理组开始,β-防御素2表达量开始提高,在100 mg/L浓度LCWE组其表达量达到最高。Western blot结果显示：生理盐水组小鼠阴道组织未检测到β-防御素2蛋白表达,而100 mg/L浓度LCWE处理组和大肠埃希菌EPEC104组均出现特异性条带。结论 LCWE可上调小鼠阴道组织β-防御素2的表达且存在着剂量依赖关系。     

鸽β-防御素5基因克隆及其抗菌活性

从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素(AvBD)基因,在大肠杆菌中高效表达,检测其重组蛋白的抗菌活性。应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。测序得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高,分别为87.9%和78.8%,这两组氨基酸序列的同源性为83.3%。因此,将其分别命名为鸽AvBD5α(骨髓)和鸽AvBD5β(肝脏)。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。两个重组融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,及其融合蛋白的溶血活性。结果表明,重组鸽AvBD 5α、AvBD 5β融合蛋白的分子量约为32 kDa。具有明显的抗菌活性,对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性显著影响。此外,这两个重组蛋白对红细胞无显著溶血活性。     

阴道乳杆菌诱导细菌性阴道病患者β-防御素2表达及其抗菌活性的研究

目的 观察阴道乳杆菌诱导阴道黏膜细胞表达β防御素-2 (hBD-2) 的情况,检测其表达,观察hBD-2的体外抗菌活性.方法 分为3组,即健康对照组(n=10)、BV组(n=10)和阴道乳杆菌干预组(n=8).采用RT-PCR半定量法,检测阴道组织hBD-2 mRNA的水平.用琼脂糖弥散法检测其抗菌活性.结果 与健康对照组相比,BV组、阴道乳杆菌干预组hBD-2 mRNA的水平明显升高(P<0.05);阴道乳杆菌干预组hBD-2 mRNA的水平较BV组增高(P<0.05);琼脂糖弥散法显示,hBD-2对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌有明显的杀灭效应.结论 阴道乳杆菌干预对BV患者治疗可以使hBD-2 mRNA表达水平上调,提示其在维系正常妇女生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染机制中起着重要的作用.     

禽类的重要免疫因子--鸡β防御素

防御素是一种阳离子抗菌肽,是先天免疫的重要分子.鸡的防御素有13种,全部属于β防御素.该文介绍鸡β防御素的基因结构、蛋白质结构、组织分布、表达调控及其生物学功能.研究结果提示,鸡β防御素是一种重要的免疫因子,具有广谱抗病作用.对鸡β防御素的开发利用将主要集中在两个方面：一是作为家禽抗病力的指标之一,在培育家禽抗病品种（品系）方面起辅助作用;一是作为抗菌肽的开发利用.     

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用（P〈0．01）,对目的蛋白的表达无显著影响（P〉0.05）,延长诱导时间对菌株生长有利（P〈0．01）,但对蛋白的表达无显著影响（P〉0.05）。以0．5％乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28,1％。控制好诱导条件,乳糖与IPTC的诱导效果基本相当。     

鸡β-防御素-1真核表达载体构建及其在Flp-In-293细胞中的表达

以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1 (Gallinacin-1,Gal-1)对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值.本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1 (+)载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1 (+)-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48 h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1 (+)-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达.本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础.     

猪β防御素2成熟肽在酵母中的表达

【目的】将猪β防御素2成熟肽基因片段正确整合到酵母基因组染色体上,从而得到稳定的猪β防御素2成熟肽的毕赤酵母表达株。实现猪β防御素2成熟肽的表达。【方法】首先参考酵母偏爱密码子,设计3段引物序列,利用PCR技术扩增得到β防御2成熟肽基因,构建了重组质粒pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2。将线性化的重组质粒电转化到毕赤酵母KM71细胞中。最后筛选得到酵母阳性克隆,通过不断调节表达条件,实现猪β防御素2成熟肽的表达。【结果】将GST-pBD-2基因序列和pBD-2基因序列分别成功整合到酵母KM71基因组中,重组毕赤酵母工程菌构建成功;重组酵母蛋白GST-pBD-2和PBD-2都成功获得了表达;PBD-2成熟肽表达上清对猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500有一定的抑制作用。【结论】获得表达pBD-2成熟肽的酵母菌株,本实验是用真核细胞表达pBD-2成熟肽的一次探索,为后续大量表达pBD-2成熟肽方法的研究打下了基础。     

孕酮和米非司酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

β-防御素(β-defensin)在雌性动物生殖道广泛存在,起免疫防御作用.为了研究孕酮与雌性生殖道β-防御素mRNA表达的关系,本实验建立绵羊(Ovis aries)输卵管上皮细胞培养体系,添加不同浓度孕酮(10~(-6),10~(-7),10~(-8),10~(-9)和10~(-10) mol/L)和孕酮拮抗剂米非司酮后提取细胞总RNA,利用实时定量PCR测定β-防御素mRNA的相对表达量.结果显示,一定浓度的孕酮(10~(-6),10~(-7),10~(-8)和10~(-9) mol/L)对培养的输卵管上皮细胞β-defensin mRNA的表达有促进作用,且不同浓度的孕酮对β-defensin mRNA的表达的影响程度不同.米非司酮极显著抑制了孕酮诱导的β-defemin mRNA的表达.结果表明,孕酮通过与孕酮受体结合促进β-defensin mRNA的表达,推断雌性生理周期下孕酮可能通过作用于β-defensin等影响自身免疫.     

小鼠β-防御素30的原核表达和纯化

目的:在原核细胞中表达小鼠β-防御素30(DEFB30),并对表达产物进行鉴定和纯化。方法:用RT-PCR方法扩增小鼠Defb30的cDNA序列,将2个拷贝的cDNA序列串联连入原核表达载体pET28(a),构建重组表达载体pET28(a)-Defb30,并将重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,以Western印迹分析表达产物His-DEFB30,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。结果:构建了Defb30基因的原核表达载体,经IPTG诱导,相对分子质量约15×103的融合蛋白获得表达,Western印迹分析证实此蛋白即为目的蛋白,经Ni-NTA柱亲和纯化,获得了高纯度的融合蛋白His-DEFB30。结论:获得了在大肠杆菌中表达的DEFB30,为研究该蛋白的免疫避孕效果、抗菌活性奠定了基础。     

脂质体介导人β防御素2基因转染膀胱上皮的实验研究

目的 探讨脂质体介导人β防御-2（humaβ-defensin2,hBD2）基因体内、外转染膀胱上皮细胞的可行性。方法采用脂质体法体外转染人膀胱上皮细胞株T24及膀胱灌注大鼠体内转染,ELISA检测细胞上清及大鼠尿液中hBD：的表达;RT—PCR及Western印迹检测细胞及大鼠膀胱中hBD：的表达;组织免疫荧光检测hBD,在膀胱黏膜的表达。结果RT—PCR及Western印迹检测显示,脂质体介导pCAGG—hBD2体、内外转染膀胱上皮细胞后均可表达重组hBD2;转染细胞上清及大鼠尿液中hBD2浓度分别为（36．5±3．2）ng／10。细胞和（4．77±1．4）ng／ml;转基因hBD2主要表达于膀胱黏膜上皮层。结论脂质体介导hBD2基因体内、外转染膀胱上皮细胞后均能获得高效表达,为泌尿系感染的防御素基因治疗提供了实验依据。     

草鱼β-防御素1的趋化活性及免疫佐剂效应研究

为了探究草鱼防御素的免疫调节作用, 研究通过Clustal Omega多序列比对和I-TASSER二级结构预测, 发现草鱼β-防御素1(Ctenopharyngodon idella β-defensin 1, CiBD1)是一类具有两亲性的富含半胱氨酸的小分子阳离子肽, 其结构在硬骨鱼类中高度保守; 通过构建pET-32a-CiBD1原核表达载体, IPTG诱导表达后经过Ni2+亲和层析法纯化和肠激酶酶切获得CiBD1重组蛋白, 通过CFU平板法验证了CiBD1的抑菌活性, 当蛋白浓度达到200 μg/mL时, 对革兰氏阴性菌(G+)及革兰氏阳性菌(G–)都具有显著的抑制活性; 趋化实验表明CiBD1在50 ng/mL时对草鱼原代白细胞趋化活性最佳; 通过个体实验探究了CiBD1重组蛋白对嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫佐剂效应, 发现添加 CiBD1佐剂组死亡率显著低于单独疫苗组, 且该组IgM和MHC Ⅱ转录水平及血清中补体3(C3)和溶菌酶含量都显著高于对照组。研究表明CiBD1重组蛋白在细菌抗感染免疫中发挥着重要作用, 在水产养殖中具有一定的应用前景。     

孕酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外实验模型,分别添加10^-6、10^-7、10^-8、10^-9和10^-10 mol/L孕酮,运用实时荧光定量PCR方法测定孕酮对上皮细胞内β-防御素相对表达量的影响。结果显示,与对照组比较,10^-6和10^-7 mol/L孕酮组β-防御素相对表达量显著升高（P<0.05）;10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著升高（P<0.01）;而10^-10 mol/L孕酮组未见显著性差异。孕酮添加组间比较显示,10^-8和10^-9 mol/L孕酮组极显著高于10^-10 mol/L组（P<0.01）,其它孕酮添加组间未见显著性差异。分析认为,一定浓度的孕酮（10^-9－10^-6 mol/L）对培养的输卵管上皮细胞β-防御素的表达有促进作用。且不同浓度的孕酮对β-防御素表达的影响程度不同。因而推断,雌性生理周期下,雌性生殖道β-防御素的表达与孕激素相关。     

防御素（Defensin）研究进展

防御素（Defensin）是近年来发现的广泛存在于动物和植物体内的一类阳离子抗菌活性肽。它们通常都是由２８－５４个氨基酸残基组成,分子内富含精氨酸和由半胱氨酸形成的分子内二硫键。它们具有广谱高效的杀菌活性,能有效地杀来革兰氏阳性菌、革半氏阴性菌、某些真菌、螺旋体、被膜病毒等微生物,因而对它们的研究已成为当前国际学术界中一个引人关注的研究热点。本文将简述有关防御素的分布、分子结构特征、生物学活性、作用机制、分子生物学特征等方面的研究概况及展望。