禽类的重要免疫因子--鸡β防御素

防御素是一种阳离子抗菌肽,是先天免疫的重要分子.鸡的防御素有13种,全部属于β防御素.该文介绍鸡β防御素的基因结构、蛋白质结构、组织分布、表达调控及其生物学功能.研究结果提示,鸡β防御素是一种重要的免疫因子,具有广谱抗病作用.对鸡β防御素的开发利用将主要集中在两个方面：一是作为家禽抗病力的指标之一,在培育家禽抗病品种（品系）方面起辅助作用;一是作为抗菌肽的开发利用.     

防御素的生物学特性及其抗病基因工程

防御素是一种富含半胱氨酸的小分子多肽,对细菌等微生物具有广谱抗性,且作用机制特殊。迄今为止,国内外在防御素方面进行了大量的研究,已经从各类生物体中分离出不同种类的防御素,并在基因工程和医药领域呈现广泛的应用前景。文章对防御素的分类、生物学特性,包括哺乳动物α-、β-、θ-防御素、昆虫以及植物防御素的分子结构及抗菌活性进行了综述,阐述了防御素的膜作用及与细胞内复合物结合的作用机制。总结和归纳了防御素基因的分离、表达研究进展及动、植物防御素基因在抗病基因工程领域的应用,并对防御素在未来的生物制药和植物抗病基因工程方面的应用前景进行了展望。     

哺乳动物β-防御素研究进展

哺乳动物β-防御素是一类小分子的阳离子抗菌多肽。其具有独特的抗菌机制和广谱抗菌、抗病毒活性,同时还可作为免疫调节剂来激活与调节机体的免疫系统,在医药开发或是动植物抗病育种等方面都具有很好的应用前景。就哺乳动物β-防御素的分布、分子结构、生物学活性、作用机制及其应用等方面的研究作一综述。     

犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽.为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达.结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank 编号:NM-001024641)的同源性为99.7%.表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外.为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础.     

长爪沙鼠β-防御素（defβ-83）基因的克隆与鉴定

目的克隆长爪沙鼠β-防御素基因序列,并对其进行鉴定及分析。方法从长爪沙鼠小肠中提取总RNA,根据GeneBank中大小鼠的β-防御素的基因序列,通过防御素基因的保守性设计引物,采用RT-PCR技术得到预期的PCR产物,将所得的片段进行克隆、测序,并应用相关生物信息学软件对序列进行鉴定和分析,序列提交genbank。结果Blast比较发现最终测序的结果与小鼠β-防御素-1和大鼠β-防御素-1的同源性全都大于80％,genebank登录号为EU834052。结论经测序鉴定证实该PCR产物为长爪沙鼠阻防御素基因1的一部分。本研究为深入探讨长爪沙鼠β-防御素的生物学活性奠定基础。     

新生仔猪肠道抗菌肽的表达特征

肠道抗菌肽(AMPs)由肠粘膜上皮细胞合成或分泌的一类防御性肽类活性物质,在肠道的先天性免疫过程中具有重要的作用。猪肠粘膜上皮细胞可分泌β-防御素2(BD2)、β-防御素3(BD3)、RegIIIγ、溶菌酶(LYS)和血管生成素4 (ANG4)等多种抗菌肽。文章通过荧光定量PCR(real-time Q-PCR)分析新生仔猪RegIIIγ、ANG4、BD2、BD3和溶菌酶等抗菌蛋白在十二指肠、空肠、回肠内不同发育阶段的mRNA的表达变化。结果表明,所有抗菌肽的mRNA水平在出生后均逐渐升高,但在断奶后的表达水平降低,随后又显著升高。此外在肠道中最主要的抗菌肽是溶菌酶和RegIIIγ,意味着这两种抗菌肽在肠粘膜的先天免疫中具有十分重要的作用。     

鱼类β-防御素的研究进展

β-防御素是一种具有六个保守的半胱氨酸位点的阳离子两亲性小分子多肽,是抗菌肽的重要成员。随着基因组学研究的不断深入,目前在鱼类中发现了20个β-防御素基因,其基因结构均是由3个外显子和2个内含子组成,并且具有广谱抗菌活性及抗病毒活性。主要从分子结构、组织分布、基因结构、生物学活性以及生物进化等方面对鱼类β-防御素的研究概况进行综述。     

地塞米松抑制卡氏肺孢子菌肺炎β2-防御素和Dectin-1受体的表达

目的研究卡氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis carinii pneumonia,PCP）鼠肺Dectin-1和β2-防御素的表达变化,探讨地塞米松对Deetin-1和B2-防御素的影响与疾病发生的相互关系。方法实验分4组：正常对照组、Pc刺激组、PCP模型组以及PCP模型恢复组。免疫抑制方法建立PCP动物模型,改良四胺银（Groeoti’s methenamine—silver nitrate method,GMS）染色检测Pc包囊;肺组织切片HE染色观察肺组织病理变化;实时荧光定量和Westernblot检测Deetin-1和B2-防御素的mRNA以及蛋白的表达。结果Pc刺激组的Dectin．1和β2-防御素的mRNA以及蛋白的表达明显高于正常对照组（P〈0．05）;Pc刺激组和PCP恢复组的Dectin-1和β2-防御素的mRNA以及蛋白显著高于PCP组（P〈0．05）,而PCP恢复组与PCP组肺部炎症无明显差别。结论对免疫功能正常宿主,Dectin-1受体和p2-防御素可能在防Pc感染中起重要作用;地塞米松抑制了鼠肺Deetin-1和β2-防御素的表达,这可能与PCP疾病的发生和发展有关。     

荷斯坦奶牛中性粒细胞β-防御素cDNA的克隆与序列分析

为研发牛β-防御素生物制剂,防治奶牛乳腺炎。根据已发表的牛β-防御素基因序列设计一对引物。收集患乳腺炎奶牛乳静脉血液中性粒细胞,用试剂盒提取总RNA。经RT-PCR扩增牛β-防御素cDNA片段,回收纯化PCR产物,连接pMD18-T载体,转化感受态细胞JM109。在含X-Gal、Amp及IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR及双酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段碱基数为189bp,含有一个完整的ORF,能编码63个氨基酸的多肽,多肽中含6个保守半胱氨酸残基。用Blast程序进行检索比较,表明扩增序列与GenBank中发表的BNBD-7编码区序列96.3%相同。结果成功克隆出奶牛β-防御素家族的成员BNBD-7基因,为重组牛β-防御素的开发奠定了基础。     

乳杆菌细胞壁成分对小鼠阴道组织β-防御素2诱导表达的影响

目的探讨乳杆菌细胞壁成分（Lactobacilluscell wall extract,LCWE）对小鼠阴道组织β-防御素2诱导表达的影响。方法将雌性ICR小鼠随机分成5组,实验组给予不同浓度的（5、20和100 mg/L）LCWE 200μL阴道接种处理;阴性对照组小鼠阴道接种生理盐水,阳性对照组小鼠阴道接种大肠埃希菌EPEC104菌液（3×109CFU/mL）,5 d后处死,取小鼠阴道组织,做阴道菌群分析评价,部分阴道组织提取总RNA,以β-actin为内参照,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测小鼠阴道组织β-防御素2表达。结果 20 mg/L和100 mg/L浓度LCWE处理后,小鼠阴道菌群较生理盐水组的肠杆菌、葡萄球菌明显减少（P〈0.05）,乳杆菌无显著性变化（P〉0.05）。生理盐水组小鼠阴道组织β-防御素2 mRNA表达量极低,大肠埃希菌阳性对照组能显著诱导小鼠阴道组织β-防御素2 mRNA的表达;5 mg/L浓度LCWE处理组开始,β-防御素2表达量开始提高,在100 mg/L浓度LCWE组其表达量达到最高。Western blot结果显示：生理盐水组小鼠阴道组织未检测到β-防御素2蛋白表达,而100 mg/L浓度LCWE处理组和大肠埃希菌EPEC104组均出现特异性条带。结论 LCWE可上调小鼠阴道组织β-防御素2的表达且存在着剂量依赖关系。     

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论 人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

孕酮和米非司酮对蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA表达的影响

β-防御素(β-defensin)在雌性动物生殖道广泛存在,起免疫防御作用.为了研究孕酮与雌性生殖道β-防御素mRNA表达的关系,本实验建立绵羊(Ovis aries)输卵管上皮细胞培养体系,添加不同浓度孕酮(10~(-6),10~(-7),10~(-8),10~(-9)和10~(-10) mol/L)和孕酮拮抗剂米非司酮后提取细胞总RNA,利用实时定量PCR测定β-防御素mRNA的相对表达量.结果显示,一定浓度的孕酮(10~(-6),10~(-7),10~(-8)和10~(-9) mol/L)对培养的输卵管上皮细胞β-defensin mRNA的表达有促进作用,且不同浓度的孕酮对β-defensin mRNA的表达的影响程度不同.米非司酮极显著抑制了孕酮诱导的β-defemin mRNA的表达.结果表明,孕酮通过与孕酮受体结合促进β-defensin mRNA的表达,推断雌性生理周期下孕酮可能通过作用于β-defensin等影响自身免疫.     

大口黑鲈β-防御素在杆状病毒系统中的表达及抑菌活性

β-防御素是鱼类天然免疫的重要组成部分, 通过杆状表达系统表达大口黑鲈β-防御素, 研究其具有高效、广谱的不同于抗生素的独特抗菌的能力。研究通过序列分析, 发现大口黑鲈β-防御素(MSBdefe)与其他物种β-防御素具有相似的特征, 都包含6个保守的半胱氨酸。将MSBdefe基因进行昆虫密码子优化合成后, 克隆至穿梭载体pYBDM-IM质粒中, 构建成为重组质粒MSBdefe-pYBDM-IM, 重组质粒转化感受态细胞MultiBac/rSW106/asd-/inv+, 阳性重组菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am直接用于Sf9细胞的感染, 获得重组杆状病毒AV-MSBdefe。通过SDS-PAGE和Western Blot检测AV-MSBdefe感染Sf9细胞后蛋白表达, 结果表明成功获得MSBdefe重组蛋白。通过对淡水鱼类最常见的病原菌嗜水气单胞菌的抑菌活性分析, 结果显示当MSBdefe重组蛋白的终浓度为30 μg/mL时, 抑菌效率为83.00%, 并随着蛋白稀释2倍、4倍后, 即终浓度为15和7.5 μg/mL时, 抑菌效果逐渐减弱, 抑菌效率分别为54.33%和33.67%, 进而验证了大口黑鲈β-防御素能够抑制嗜水气单胞菌的生长, 且随着蛋白浓度的降低抑制能力下降。这些结果为利用昆虫生物反应器规模化生产鱼类β-防御素奠定了基础, 以期为开发能够替代或部分替代抗生素的天然抗菌剂提供良好的候选者和技术途径。     

人防御素的研究进展

人防御素是近年发现的人体内重要的内源性抗生素,已引起国内外生物和医学研究者的日益重视。这里综述了人防御素的组织分布、分子生物学特点、作用机理、医学及药用价值等方面的研究进展,对采用基因重组方法生产人防御素的方法进行了评述,并展望了防御素的应用前景和发展趋势。     

防御素在抗病毒免疫中的作用

防御素是由粒性白细胞和上皮细胞产生、富含半胱氨酸的内源性抗微生物肽。越来越多的证据表明防御素在抗病毒免疫中发挥重要作用,包括抗病毒作用和免疫调节。深入理解防御素在抗病毒免疫中的作用有助于预防和治疗病毒病。因此。该文重点综述防御素的抗病毒活性和免疫调节作用。     

人防御素分子生物学研究进展及其应用

人防御素(human defensins)是一类内源性阳离子抗微生物肽,在天然免疫防御中起重要作用,也能增强继承性免疫应答.它具有强烈的广谱抗微生物活性,并且不易对微生物产生耐药性.对人防御素的分子生物学特性方面的研究进展作一综述,重点在于比较和探讨其结构的异同,并对其应用和发展的前景进行展望.     

b型流感嗜血杆菌结合疫苗促进人气道上皮细胞hBD-2表达

目的:检验b型流感嗜血杆菌结合疫苗在体外能否刺激人气道上皮细胞hBD-2表达,并探讨人工诱导防御素表达的方法.方法:体外分离、培养原代人气道上皮细胞.b型流感嗜血杆菌疫苗刺激原代人气道上皮细胞后,用RT-PCR和ELISA法检测培养上清液中hBD-2蛋白的表达.收集刺激后的细胞培养上清液进行抑菌实验.结果:浓度＞1 μg/ml的b型流感嗜血杆菌结合疫苗刺激原代人气道上皮细胞12h后,可诱导hBD-2 mRNA的表达,与对照组相比较有显著差异(P＜0.01),无剂量依赖性,同时细胞培养上清液中hBD-2蛋白的表达上调.1μg/mlb型流感嗜血杆菌结合疫苗浓缩后的细胞培养上清液具有抑菌作用.结论:一定浓度(1μg/mL)以上的b型流感嗜血杆菌结合疫苗作用于人原代气道上皮细胞可诱导hBD-2的表达,为人工方法刺激机体产生人β防御素-2,对抗病原菌感染提供新的策略.     

髓源性防御素的研究进展

防御素是一组含有6个半胱氨酸的阳离子抗微生物多肽。在中性粒细胞内,防御素含量丰富,具有广谱、高效的抗微生物活性,是机体天然免疫机制的重要组成部分。近年来的临床观察表明,测定血浆及各种体液中髓源性防御素的改变有助于某些炎症性疾患的诊断。此外,提纯或重组防御素作为“超级抗生素”则已成为药学界的研究热点。本文着重对髓源性防御素的生化特性、生物学活性及其与疾病的关系作一概述。     

猪β防御素2成熟肽在酵母中的表达

【目的】将猪β防御素2成熟肽基因片段正确整合到酵母基因组染色体上,从而得到稳定的猪β防御素2成熟肽的毕赤酵母表达株。实现猪β防御素2成熟肽的表达。【方法】首先参考酵母偏爱密码子,设计3段引物序列,利用PCR技术扩增得到β防御2成熟肽基因,构建了重组质粒pPIC9k-GST-pBD-2和pPIC9k-pBD-2。将线性化的重组质粒电转化到毕赤酵母KM71细胞中。最后筛选得到酵母阳性克隆,通过不断调节表达条件,实现猪β防御素2成熟肽的表达。【结果】将GST-pBD-2基因序列和pBD-2基因序列分别成功整合到酵母KM71基因组中,重组毕赤酵母工程菌构建成功;重组酵母蛋白GST-pBD-2和PBD-2都成功获得了表达;PBD-2成熟肽表达上清对猪霍乱沙门氏菌弱毒株C500有一定的抑制作用。【结论】获得表达pBD-2成熟肽的酵母菌株,本实验是用真核细胞表达pBD-2成熟肽的一次探索,为后续大量表达pBD-2成熟肽方法的研究打下了基础。     

基于多拷贝鳜鱼β-防御素基因的重组毕赤酵母菌株构建

鳜鱼β-防御素(Siniperca chuatsi β-defensin,ScBD)作为一种重要的蛋白质免疫因子,在其抵御病原微生物侵染的过程中起到了重要的作用,被认为是开发天然抗菌剂的理想候选者.ScBD的初级结构含信号肽和成熟肽,后者由43个氨基酸残基组成,决定了其生物学活性.通过同源建模法预测了ScBD的空间结构...