乙醇脱氢酶Ⅱ活性低谷胱甘肽含量高的啤酒酵母工程菌

微生物代谢工程是当前国内外研究的热点.在食品、能源、环境等领域,通过遗传修饰改变微生物的物质和能量代谢流向以获得期望产物的研究已广泛地开展.乙醛是啤酒中重要的风味物质之一,过高的乙醛含量已成为国内啤酒风味改良的瓶颈,一直难有突破.     

低双乙酰抗老化啤酒酵母工程菌的构建

用来源于啤酒酵母的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（GSH1）和铜抗性基因（CUP1）取代质粒pLZ-2中α-乙酰乳酸合成酶基因（ILV2）内部约2.3kb的DNA片段,构建成重组质粒pICG。限制酶酶切质粒pICG后获得在基因GSH1和CUP1两端含有ILV2序列的6.0kb的DNA片段。用此片段转化啤酒酵母YSF31,得到铜抗性高的转化子。并通过PCR和α-乙酰乳酸合成酶（AHAS）活性测定筛选到酵母工程菌。小试实验结果表明酵母工程菌谷胱甘肽含量比受体高34％,而双乙酰含量是受体的75％。其他发酵指标并没有发生改变。中试实验表明酵母工程菌发酵周期缩短3d,而且成品啤酒的保鲜时间延长50％。由于DNA操作过程中没有外源基因介入,因此啤酒酵母工程菌为生物安全的自克隆菌株,具有重要的实际应用价值。     

啤酒酵母乙醇脱氢酶Ⅰ(ADHI)的遗传变异

在啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中观察到存在一种新的ADHI:ADHIF,电泳迁移率明显快于文献报道的ADHI:ADHIS。这种ADHIF在10％葡萄糖的培养条件下,以及在呼吸缺陷型菌株进行无氧呼吸时都能够出现。ADHIF性状的遗传分析表明,它受1个与结构基因ADC-1S(编码ADHIS)等位的基因ADC-1F控制。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶2(ADH2)基因的克隆表达及活性验证

为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。     

具有a-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工程菌的构建

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)因具有较强的a-淀粉酶以及葡聚糖酶活性, 使其在以淀粉为唯一碳源的培养基上能够良好的生长。从其基因组中克隆了a-淀粉酶的编码区, 构建了由酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子、酿酒酵母a-因子信号序列以及扣囊复膜酵母a-淀粉酶基因编码序列组成的基因表达盒。将该表达盒插入到质粒pPLZ-2的ILV2基因序列内部, 使其两翼具有ILV2基因的同源区。将该表达盒通过同源重组的方式整合到啤酒酵母工业菌株YSF-5的a-乙酰乳酸合成酶(AHAS)基因ILV2内部。在以淀粉为唯一碳源的培养基上进行转化子的筛选。通过多对引物PCR、a-淀粉酶活性以及AHAS活性分析对转化子进行鉴定, 得到一株具有a-淀粉酶分泌表达活性、较低AHAS活性, 并且发酵液中双乙酰产量也相对较低的啤酒酵母工程菌。该菌株在非选择压力条件下连续培养50代后仍然保持其遗传稳定性。还对pH、温度以及金属离子对该转化菌株的a-淀粉酶活性的影响进行了研究。由于所构建的菌株不含有非酵母来源的DNA, 所以生物安全性相对较高, 对酵母育种以及啤酒生产工业都具有较为重要的意义。     

具有a-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工程菌的构建

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)因具有较强的a-淀粉酶以及葡聚糖酶活性, 使其在以淀粉为唯一碳源的培养基上能够良好的生长。从其基因组中克隆了a-淀粉酶的编码区, 构建了由酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子、酿酒酵母a-因子信号序列以及扣囊复膜酵母a-淀粉酶基因编码序列组成的基因表达盒。将该表达盒插入到质粒pPLZ-2的ILV2基因序列内部, 使其两翼具有ILV2基因的同源区。将该表达盒通过同源重组的方式整合到啤酒酵母工业菌株YSF-5的a-乙酰乳酸合成酶(AHAS)基因ILV2内部。在以淀粉为唯一碳源的培养基上进行转化子的筛选。通过多对引物PCR、a-淀粉酶活性以及AHAS活性分析对转化子进行鉴定, 得到一株具有a-淀粉酶分泌表达活性、较低AHAS活性, 并且发酵液中双乙酰产量也相对较低的啤酒酵母工程菌。该菌株在非选择压力条件下连续培养50代后仍然保持其遗传稳定性。还对pH、温度以及金属离子对该转化菌株的a-淀粉酶活性的影响进行了研究。由于所构建的菌株不含有非酵母来源的DNA, 所以生物安全性相对较高, 对酵母育种以及啤酒生产工业都具有较为重要的意义。     

构建高产谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究

根据同源重组的原理,将来源于啤酒酵母工业菌株G03的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（GSH1）和筛选标记Kan取代质粒pRJ-5中18S rDNA内部约340bp的DNA片段,构建重组质粒pRKG。以pRKG为模版,PCR得到以18S rDNA为整合位点包含GSH1和Kan的基因片段18S rDNA::(Kan-GSH1)。用此片段转化啤酒酵母工业菌株G03,通过G418抗性筛选得到啤酒酵母工程菌。实验室小试表明,工程菌的谷胱甘肽含量比受体菌株提高16.6%,啤酒的抗老化能力得到了显著提高,而常规指标没有发生显著变化。连续传代5次后胞内GSH含量基本不变遗传稳定性良好。由于表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因来源于受体菌株自身,是通过自克隆技术改造工业啤酒酵母的一次有益的尝试。     

缺氧条件诱导玉米根系乙醇脱氢酶活性的调节作用

缺氧条件诱导玉米根系乙醇脱氢酶活性的调节作用刘晓忠汪宗立（江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所,南京２１００１４）ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮＯＦＡＤＨＡＣＴＩＶＩＴＹＩＮＤＵＣＥＤＢＹＨＹＰＯＸＩＣＣＯＮＤＩＴＩＯＮＩＮＣＯＲＮＲＯＯＴＳＬｉｕＸｉａｏ－...     

构建高产谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究

根据同源重组的原理,将来源于啤酒酵母工业菌株G03的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)和筛选标记Kan取代质粒pRJ-5中18S rDNA内部约340bp的DNA片段,构建重组质粒pRKG。以pRKG为模版,PCR得到以18S rDNA为整合位点包含GSH1和Kan的基因片段18S rDNA::(Kan-GSH1)。用此片段转化啤酒酵母工业菌株G03,通过G418抗性筛选得到啤酒酵母工程菌。实验室小试表明,工程菌的谷胱甘肽含量比受体菌株提高16.6%,啤酒的抗老化能力得到了显著提高,而常规指标没有发生显著变化。连续传代5次后胞内GSH含量基本不变遗传稳定性良好。由于表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因来源于受体菌株自身,是通过自克隆技术改造工业啤酒酵母的一次有益的尝试。     

葡萄乙醇脱氢酶基因Ⅲ的电子克隆及生物信息学分析

利用电子克隆方法获得葡萄乙醇脱氢酶基因Ⅲ(ADHⅢ),并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构以及功能域等方面进行了预测和分析.结果表明,葡萄ADHⅢ基因全长1 602 bp,包含1 140 bp的ORF,编码379个氨基酸,该蛋白不具有明显的疏水区域,也无跨膜结构域,α-螺旋和不规则卷曲是其二级结构的主要构件.葡萄ADHⅢ包含有ADH功能域,和其他植物的ADHⅢ在序列组成、高级结构及活性位点等方面均具有高度的相似性.     

自克隆技术在工业啤酒酵母改良中的研究概况

自克隆技术由于具有生物安全的优点,已成为对工业微生物、尤其是食品微生物进行遗传修饰的首选技术,简要介绍了自克隆技术在工业啤酒酵母菌种改良中的研究概况。     

葡萄酒工业酵母生孢特性研究

孢子是单倍体配子,由于具有遗传型与表现型相一致的优点,是遗传学上常用的材料。用工业化葡萄酒活性干酵母进行生孢试验,结果表明,供试8支菌种均可生孢,但生孢率与孢子形态相差较大。其中,17#生孢最强,30#、29#、27#次之,28#、18#、26#渐弱,32#生孢最弱。子囊多为圆形大细胞,孢子多为球形或卵圆形,子囊内一般含2~4个孢子,但29#中可见5~6个孢子。     

特殊酵母工业应用专利发展态势分析

特殊酵母作为区别于传统酵母之外的一类生物资源,具有广泛的工业应用前景.基于incoPat数据库收录的专利数据,以特殊酵母工业应用领域的专利为研究对象,从专利分析的角度,揭示了全球特殊酵母工业应用领域技术创新的发展态势、技术分布、主要申请机构、研究热点以及各类特殊酵母的应用优势等.结果表明:全球特殊酵母工业应用领域的专利...     

啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对啤酒风味稳定性的影响

以pUG6为模板, 设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物, 构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒, 转化啤酒酵母G-03, 获得一株G-03/a转化菌, 遗传稳定性良好, 测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)分泌量在对数生长期分别比原菌高21.4%和14.7%。在锥形瓶中连续发酵4代后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1%和13.8%, 发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7%和5.3%, 成品啤酒RSV值提高45.0%。EBC管发酵6 d后, 与原菌株相比, 转化菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0%。转化菌G-03/a与G-03所酿制成品啤酒的常规指标没有显著差别。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母, 能够提高啤酒的风味稳定性。     

Enzyme purification with aqueous two-phase systems: comparison between systems composed of pure polymers and systems composed of crude polymers

The main drawback when using aqueous two-phase systems for macromolecule purification is the high cost of most polymers used. The purification of an enzyme, alcohol dehydrogenase, from a crude extract of Saccharomyces cerevisiae was tested in systems composed of poly(ethylene glycol) and a crude hydroxypropyl starch or Reppal PES 100, a purified fraction of hydroxypropyl starch. Purification factors measured for the enzyme were very similar in both systems (between 0.8 and 1.4 for both systems in the upper phase). However, systems composed of Reppal PES present a greater recovery of enzyme, between 77% and 100% versus 60% and 100%, while systems composed of crude hydroxypropyl starch exhibit a larger Δlog K for the tested ligand, 1.26 versus 0.81.