大鼠肝脏细胞核糖皮质激素受体的测定

低浓度25nM以下的[~3H]皮质酮和大鼠肝脏细胞核的特异结台位点具有低容量、高亲和力,和甾体激素结合的特异性等特点,其特异结合量和由胞浆转位到核内的糖皮质激素——受体复合物的量平行,证明该结合位点是具有生理意义的糖皮质激素核受体。实验表明,用20nM的[~3H]皮质酮作一点分析是测定大鼠肝脏细胞核糖皮质激素受体的简便方法。用此法测定了13只成年雌性大鼠肝脏细胞核内的糖皮质激素受体,结果为34.5±4.5fmol/mg DNA。     

大鼠脑突触质膜糖皮质激素受体样抗原的免疫电镜研究

本文利用ABC金标记法(受体-抗受体中的单克隆抗体-生物素化马抗鼠IgG-金标链霉亲和素),首次在电镜下观察到大鼠脑突触质膜的外表面存在有糖皮质激素受体样抗原,为神经细胞膜上可能存在有糖皮质激素受体提供了形态学依据。     

大鼠脑突触质膜糖皮质激素结合位点的等电点测定

利用离子交换层析法测定了大鼠脑突触质膜糖皮质激素结合位点的等电点,结果表明,膜糖皮质激素结合位点的等电点为5.5,与细胞内糖皮质激素受体的等电点(pI6.7)不同。     

糖皮质激素受体的结构和功能

近年来已克隆出人、大鼠和小鼠糖皮质激素受体的cDNA,并利用定点突变等技术分析了受体结构和功能的关系。还利用小鼠乳腺瘤病毒、人金属硫蛋白II_A基因等详细研究了受体和DNA的相互作用,对糖皮质激素的诱导蛋白也进行了深入研究。     

糖皮质激素受体减少在休克发生中的作用——一个新假说

用放射配体结合法和单抗测定结果表明,各种原因所致的应激在人、大鼠和狗的各脏器都引起糖皮质激素受体（GR）减少。给大鼠注射RU486阻断GR的实验结果证明,GR减少导致受体水平上的肾上腺皮质功能不全,从而使内毒素血症和失血大鼠的病变明显加重。由此,我们提出了休克发生的GR减少假说。关于应激时GR减少的机制,除了血浆糖皮质激素水平升高使GR减少之外;很可能还是热休克反应的一个表现。     

单克隆抗体检测糖皮质激素受体的方法

利用两种糖皮质激素受体(GR)的单克隆抗体(Mab)建立了免疫活性糖皮质激素受体(GR_1R)的ELlSA检测法。5只大鼠肝胞液GR_1R/mg蛋白为1.0875±0.0257(扫描值)。本法特异性好,适用于没有GR纯品,而Mab数量不多条件下GR_1R的检测,其原理也适用于其他受体蛋白的测定。     

糖皮质激素受体及其反应元件

糖皮质激素受体及其反应元件孙琳琳宋亮年（第二军医大学病理生理学教研室,上海２００４３３）关键词糖皮质激素受体糖皮质激素反应元件糖皮质激素受体（ＧＲ）是核受体超家族中的重要成员,也是一种典型的激素依赖性转录调节因子,与激素结合后通过和靶基因中的糖皮质激...     

糖皮质激素受体的研究进展

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)在机体的生命活动中具有重要作用.它是激素核受体家族中的一个主要成员,同时也是一种重要的核转录因子,转录调控多种基因表达.糖皮质激素作用的发挥必须与糖皮质激素受体结合.糖皮质激素受体不仅能参与机体应激反应,而且具有抗炎抗免疫作用和促细胞凋亡作用.目前已知的GR有三种类型,分别为α、β和P型,糖皮质激素受体在应激及GC抵抗中扮演着重要的角色.     

RU486逆转糖皮质激素对淋巴细胞表达白细胞介素-2受体的抑制作用

本文采用荧光标记ＣＤ２５单抗和放射性配基结合分析实验,观察了ＲＵ４８６对地塞米松抑制淋巴细胞表达高、低亲和力ＩＬ２受体的影响。结果显示,与地塞米松共同培养４８小时的大鼠脾淋巴细胞,高、低亲和力ＩＬ２受体的表达明显降低;在含有地塞米松的淋巴细胞培养体系中加入ＲＵ４８６后,表达ＣＤ２５（低亲和力ＩＬ２受体）的阳性细胞率显著升高,淋巴细胞表面的高亲和力ＩＬ２受体数量明显增加,基本恢复至正常水平。以上结果提示,糖皮质激素对淋巴细胞表达ＩＬ２受体的下调作用可能是通过淋巴细胞内的糖皮质激素受体介导的。     

病理性应激时大鼠肝胞液糖皮质激素受体的变化

以[~3H]地塞米松为配体,用交换法测定了对照和烫伤性应激大鼠肝胞液的糖皮质激素受体的结合容量(R_0)和表面上的解离常数(K_d)。烫伤大鼠肝胞液的 R_0减少。烫伤后1、12和24小时的凡分别为对照组的76 4±15.2、70.6±22.0和79.7±5.8%(均值±标准差)。烫伤后1小时 K_d 略为增大。为了确定 R_0是否真的减少,用去肾上腺大鼠的肝胞液加6nM 皮质酮后,再测定[~3H]地塞米松特异结合的 R_0和 K_d,结果表明,在我们所用的交换测定条件下,内源性皮质酮浓度在6nM 以下时,对测定结果没有明显的影响。而对照组和烫伤组肝胞液的皮质酮浓度平均都不超过6nM。因此可以认为烫伤大鼠肝胞液糖皮质激素受体的 R_0和 K_d 的变化不是由于内源性皮质酮占据受体的结果。其机制有待进一步的研究。     

两相分配法制备南极红酵母质膜

用葡聚糖 T-500(Dextran T-500)和聚乙二醇(PEG-3350)两相体系制备南极红酵母(Rhodotorula sp.)菌株 NJ298 的质膜.首先在 2 mmol/L KCl 浓度下,选用5种不同的聚合物浓度(5.6%、5.8%、6.0%、6.2%、6.4%,W/W),研究了 NJ298 质膜在两相体系中的分配情况,在此基础上进一步研究了 KCl 浓度(2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L)对 NJ298 质膜的纯度及得率的影响.结果表明,选用6.0%聚合物浓度,4 mmol/LKCl 的两相分配体系,分离3次可得到相对纯度在 78.2%的南极红酵母质膜组分,标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡.这为进一步研究该菌株的南极极端环境适应机制奠定了基础.     

膜渗滤亲和层析法纯化腹水单克隆抗体

用膜渗滤亲和层析法纯化腹水单克隆抗体（McAb）.采用硝酸纤维素膜（NCM）作固相支持物吸附抗原,用负压使小鼠腹水渗滤NCM,在滤过的同时腹水中的McAb不断结合于NCM上吸附的抗原,再将McAb从NCM上解离,从而得到高纯度的McAb.用此法纯化抗白蛋白（Alb）McAb.结果提纯的Alb McAb纯度达PAGE电泳单条带,将此McAb点样NCM用于斑点免疫渗滤法（DIFA）检测Alb,其灵敏度比用腹水点样时高20倍.该法快速简便,可代替亲和层析柱用于纯化McAb.     

多维色谱-串联质谱联用技术分离和鉴定小鼠肝脏质膜蛋白质

采用自动在线纳流多维液相色谱 串联质谱联用的方法分离和鉴定蔗糖密度梯度离心法分离和富集的小鼠肝脏质膜蛋白质 .以强阳离子交换柱为第一相 ,反相柱为第二相 ,在两相之间连接一预柱脱盐和浓缩肽段 .用含去污剂的溶剂提取细胞质膜中的蛋白质 ,获得的质膜蛋白质经酶解和适当的酸化后通过离子交换柱吸附 ,分别用 10个不同浓度的乙酸铵盐溶液进行分段洗脱 .洗脱物经预柱脱盐和浓缩后进入毛细管反相柱进行反相分离 ,分离后的肽段直接进入质谱仪离子源进行一级和二级质谱分析 .质谱仪采得的数据经计算机处理后用Mascot软件进行蛋白质数据库搜寻 ,共鉴定出 12 6种蛋白质 ,其中 4 1种为膜蛋白 ,包括与膜相关的蛋白质和具有多个跨膜区的整合膜蛋白 ,为建立质膜蛋白质组学研究的适宜方法和质膜蛋白质数据库提供了有价值的基础性研究资料 .     

两相分配法制备南极红酵母质膜

用葡聚糖T-500(Dextran T-500)和聚乙二醇(PEG-3350)两相体系制备南极红酵母(Rhodotorula sp.)菌株 NJ298的质膜。首先在2 mmol/L KCl浓度下, 选用5种不同的聚合物浓度(5.6%、5.8%、6.0%、6.2%、6.4 %, W/W), 研究了NJ298质膜在两相体系中的分配情况, 在此基础上进一步研究了KCl浓度(2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L)对NJ298质膜的纯度及得率的影响。结果表明, 选用6.0%聚合物浓度, 4 mmol/L KCl的两相分配体系, 分离3次可得到相对纯度在78.2%的南极红酵母质膜组分, 标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡。这为进一步研究该菌株的南极极端环境适应机制奠定了基础。     

蛋白质组研究中细胞质膜的纯化和纯度鉴定研究进展

细胞质膜是构成细胞对外界环境的屏障和细胞内外环境交流的界面,镶嵌或连接于其中的蛋白质参与细胞/细胞以及细胞/细胞外基质的识别、信号的接受和跨膜传导、细胞内外物质的转运;此外,质膜蛋白质在药物研发中也起着非常重要的作用,在现有的药靶中质膜蛋白质占70%.因此质膜蛋白质组学研究成为亚细胞蛋白质组学研究的热点.然而在质膜蛋白质组学的研究中,由于很难获得高纯度的质膜样品,因此这一领域的研究具有很大的挑战性.现主要对质膜及其微区结构的纯化方法和质膜纯度的评价标准作扼要的介绍.     

两相分配法制备玉米根质膜及其纯度鉴定

用ＤｅｘｔｒａｎＴ５００,ＰＥＧ３３５０两相体系制备玉米根质膜．首先在高盐浓度（２２ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ）下选用五种不同的聚合物浓度（５．８％、６．０％、６．２％、６．３％、６．４％,Ｗ／Ｗ）,研究了玉米根质膜在两相体系中的分配情况,在此基础上进一步研究了Ｎａ－Ｃｌ浓度（２、４、５、１１、２２ｍｍｏｌ／Ｌ）对玉米根质膜的纯度及得率的影响．结果表明,制备玉米根质膜选用６．２％（Ｗ／Ｗ）聚合物浓度,７．５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的两相体系比较合适．标志酶鉴定及低ｐＨ值磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡,质膜标志酶ＶＯ３－４－ＡＴＰａｓｅ的活性潜势达８８．９％．     

大鼠海马细胞质膜的分离及其蛋白质组学分析

运用差速离心和连续蔗糖密度梯度离心的方法分离纯化成年大鼠海马组织细胞质膜并用Western blotting对质膜样品进行检测.结果表明,在蔗糖密度梯度离心介质中,膜片主要集中于蔗糖浓度为32%~42%的区段(密度约1.13~1.18),其次是20%~25% (密度约1.08~1.10)的区段.39%(密度约1.17)层面上质膜浓度和纯度最高.一维SDS-PAGE分离和CapLC-MS/MS分析后,通过数据库搜寻从大鼠海马组织细胞质膜样品中共鉴定出135种蛋白质, 其中质膜蛋白和与膜相关的蛋白质共70种(占51.9%), 主要包括Na⁺/K⁺-ATPase、Glutamate/aspartate transporter、Lipophilin、GLAST 1a等. 为研究海马组织细胞的功能和大鼠海马组织细胞质膜蛋白质数据库的建立积累了有价值的资料.     

小麦旗叶高纯度质膜的提取及蛋白质组学双向电泳体系的建立

以生长到Feekes 8.5时期小麦旗叶为试验材料,通过差速离心结合两相法提取 并纯化质膜蛋白,进而在裂解液选择、SDS-PAGE胶浓度及蛋白质上样量等方面对质膜蛋白质双向电泳体系进行了优化.结果表明,采用6.4% PEG 3 350/Dextran T-500 (W/W)两相体系可以获得纯度高达87.9%质膜微囊. 经TCA-丙酮法裂解蛋白,以12% SDS-PAGE分离胶对900 μg质膜蛋白进行双向电泳,在2-DE图谱上可分辨出173个蛋白点. 建立了一套用于小麦旗叶高纯度质膜的提取方法及其蛋白质组学双向电泳体系.     

IDA型固定化镍离子金属螯合亲和膜色谱对人血清白蛋白的分离纯化

采用自制的固定化镍离子亚氨二乙酸(IDA)型复合纤维素金属螯合膜色谱对药用人血清白蛋白的进一步纯化进行了研究。考察了Ph对HAS吸附效果的影响。经一步纯化,商品药用HAS中的许多杂蛋白可被除去,经毛细管电泳分析,纯度与Sigma公司的电泳纯HAS相当,回收率可达85%以上。纯化蛋白液中的镍离子经过自制的N,N,N′-三羧甲基乙二胺(TED)型螯合柱处理后可较好地除去。     

水稻根质膜蛋白质组双向电泳水化液的优化

以水稻(Oryza sativa L.)苗期幼嫩根尖作为材料,利用葡聚糖-聚乙二醇两相分配法纯化得到纯度达90%的质膜组分,使用4种不同的水化液溶解质膜蛋白,进行IEF/SDS-PAGE双向电泳和MALDI-TOF/TOF质谱分析.结果显示,4种水化液中,以7 mol/L Urea2、mol/L Thiourea、4%CHAPS、20 mmol/L DTE、1%ASB14的条件对膜蛋白的溶解效果和双向电泳分离效果最好;16个被鉴定蛋白中有9个为质膜相关蛋白,5个为未知蛋白,来自其它细胞器的蛋白仅有2个.研究表明,在常用水化液中添加磺基甘氨酸三甲内盐ASB14有利于植物细胞质膜蛋白质组的分析,并且该优化条件下的双向电泳适合分离水稻质膜中亲水性相对较高的膜附着蛋白.