鲤鱼（Cyprinus carpio）生长激素基因的亚克隆及其序列分析

本文对ＰＣＲ扩增的６６８ｂｐ的ＤＮＡ片段进行了亚克隆,然后以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧中止法为原理,利用美国ＡＢＩ公司３７０Ａ自动核酸序列分析仪,确定了６６８ｂｐ的核苷酸序列。序列分析表明鲤鱼生长激素基因的开放读框含有６３０ｂｐ,并推测其中包括２２个氨基酸的信号肽和１８８个氨基酸的成熟多肽。鲤鱼生长激素基因的酶切图谱和序列分析的结果都证明我们已获得了全长的鲤鱼生长激素基因。     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是钱定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹鳟鱼生长激素cDNA上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快20％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（F.1,插入0．8Kb,位于XbaI和PstI之间)的表达质粒（Fig.2,命名为pCMV－TK－CGH）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,注射了1000粒卵,获得了转基因实验鲫鱼480尾。孵化率为48％。将其中100尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的50尾进行PCR检测。其中8条鱼的基因组DNA有0．6Kb的PCR扩增产物（Fig.3),表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为16％。其中最大的一条体重4．2g,体和6cm,比对照（0．7g,4cm）体重增加5倍,体长增加2cm(Fig.4)。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和人单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（属强启动子）,对鲤鱼生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因的同源性,对转基因鲫鱼的PCR检测参照了加拿大学者Du所用引物的设计、使注射的外源基因与其本身的内源生长激素基因相区别。我们的转基因整合率（16％）与Zhang(10%)、Grass和Hackett等报道的接近。转基因鲫鱼生长速度增加的倍数（5倍）与Du等人的结果（2－6）接近。但是,这一生长速度快的优势能否遗传给后代,有待进一步观察。     

南方鲇生长激素完整cDNA的克隆及其DNA序列分析

采用RT-PCR法和3'、5'RACE(Rapid amplification of cDNA ends）法从南方鲇脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH）cDNA。此cDNA全长1087nt(含Rloy(A)),其5'端非编码区长52nt、阅读框（Open rdading frame,ORF）长603nt、3'端非编码区长415nt。其推导的GH由200个氨基酸组成,其中前24个氨基酸为信号肽部分。氨基酸序列比较表明,南方鲇（GH）与Pangasianodon gigas、Ictalurus punctatus 和Heteropneustes fossilis三种鲇类的同源性分别为97.5%和95.0%,与鲢、鳙、草、鲤鱼的GH同源性达76.0%以上,而与人的GH(I、Ⅱ)同源性最低为31.0%和29.5%。     

大麻哈鱼生长激素基因Ⅱ的分子克隆和序列分析

以λ噬菌体ＥＭＢＬ－３为基因载体,构建大麻哈鱼（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｋｅｔａ）基因组文库,并从中分离出含全长的生长激素（ｃｓＧＨ）基因的克隆。本研究首次报道了对ｃｓＧＨ全长核苷酸序列分析的结果。发现ｃｓＧＨ基因由６个外显子和５个内含子组成,长度为３３６１碱基对（ｂｐ）。由该序列可推导出含２１０个氨基酸的多肽,其中存在２２个疏水氨基酸残基的信号肽。本研究所分析的ｃｓＧＨ的外显子和内含子,其排列方式与其他鲑类（Ｓａｌｍｏｎｉｄｓ）和罗非鱼（Ｔｉｌａｐｉａ）是相似的,而与鲤科鱼类（Ｃａｒｐｓ）不同,后者外显子和内含子的排列方式与哺乳类和鸟类相似。将所测定的 ｃｓＧＨ基因的编码区与已发表的 ｃｓＧＨⅡ和ｃｓＧＨ Ⅱ两种 ｃＤＮＡ序列进行比较,证明本研究所克隆的 ｃｓＧＨ基因应属于 ｃｓＧＨ Ⅱ,因它们的编码序列 １００％同源。     

枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及其序列分析

根据Lampel报道的葡萄糖脱氢酶基因序列设计合成两条引物,以野生型枯草芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增得到含有葡萄糖脱氢酶基因的大约780bp的DNA片段,将其克隆到pUC-T载体中。序列分析表明,克隆得到的葡萄糖脱氢酶基因含有783bp,编码261个氨基酸的蛋白质。得到的基因序列与文献报道的进行比较,其核苷酸同源率为75．5％,编码氨基酸序列的同源率为83．9％。     

青鱼生长激素cNDA的克隆与序列分析

从青鱼（Mylopharyngodon piceus）脑下垂体中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增出青鱼生长激素cDNA编码区,克隆到Pucm-T载体上。序列测定表明青鱼生长激素基因的开放阅读框架含有630bp,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽,青鱼生长激素基因的克隆成功为该基因的功能及应用研究奠定了基础。     

鲤鱼生长激素基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）改造了锂鱼生长激素基因,扩增出编码锂鱼生长激素成熟肽的序列,并将此序列克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ⅱ ＫＳ质粒中,序列分析后,亚克隆到大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描,结果表明锂鱼生长激素基因已大肠杆菌中获得表达。锂鱼生长激素成熟肽的分子量为２２０００道尔顿,表达率占细胞总蛋白的１８％以上％。     

用无细胞克隆系统进行特异DNA扩增的技术—PCR

作为分子生物学基石之一的分子克隆技术,是一系列技术的总称,包括目的基因的提纯,选择有自主复制能力的载体DNA,选用不同的限制性内切酶,构建新的重组DNA,导入受体细胞,重组DNA的转化,转化后遗传物质和性状的转移及重新组合,重组DNA的纯化扩增等。该系列技术的操作相当复杂繁琐且耗时长。如何从极微量的生物材料中简便快速地得到大量特定的基因,或是在众多复杂的生物基因DNA中,     

小麦叶绿体psbA基因PCR扩增及其克隆

利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)对小麦叶绿体的psbA基因进行特异性扩增,并以pBSD+质粒为载体将完整的psbA基因克隆到E.c oli中。通过分子杂交,PCR反应和酶切分析证明,重组质粒pTD1Ⅱ中含有完整的小麦叶绿体psbA基因。     

扩增未知序列DNA片段的PCR技术研究进展

1985年,Mullis等人发明了PCR技术,短短十余年间,这一技术得到迅速发展和应用,已由扩增已知基因发展到扩增未知基因,本文旨在介绍利用PCR技术扩增未知序列DNA片段的最新进展及这些技术在基因克隆研究中的应用。     

大黄鱼生长激素基因的分离及序列测定

本文从大黄鱼 (Pseucdosiaenacrocea)脑下垂体中提取得到总RNA ,根据近源鱼种生长激素(GH)基因保守序列设计了上游和下游引物 ,通过反转录和PCR扩增得到大黄鱼生长激素cDNA片断 ,并进行序列分析。所得到的序列与近源鱼种生长激素基因序列有较高的同源性 ,断定为大黄鱼生长激素基因序列 ,本序列的测定对进一步研究其生物活性和在工程菌中的表达及应用打下了基础。     

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

解放军军需大学军事兽医研究所夏平安、江禹和中国农业大学生物学院刘维全等研究人员对此课题作了研究,他们认为家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源。根据3种家蝇卵黄蛋白cDNA保守序列设计引物,用PCR技术从家蝇基因组DNA中扩增到大小为768bp的mdyp1基因的部分DNA片段,     

大黄鱼生长激素基因的分离及序列测定

本文从大黄鱼（Pseucdosiaena crocea)脑下垂体中提取得到总RNA,根据近源鱼种生长激素（GH）基因保守序列设计了上游和下游引物,通过反转录和PC扩增得到大黄鱼生长激素cDNA片断,并进行序列分析。所得到的序列与近源鱼种生长激素基因序列有较高的同源性,断定为大黄鱼生长激素基因序列,本序列的测定对进一步研究其生物活性和工程菌中的表达及应用打下了基础。     

伪狂犬病毒蛋白激酶基因的PCR扩增及其克隆鉴定

以ＢＨＫ－２１细胞单层上增殖的伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）,经离心浓缩后,用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ消化法分离纯化ＰＲＶ基因组ＤＮＡ。参照ＰＲＶＫａ株和ＮＩＡ－３株蛋白激酶（ＰＫ）基因的ＤＮＡ序列,设计并合成了一对长度为２６ｂｐ和３２ｂｐ的引物,以纯化的ＰＲＶ基因组ＤＮＡ为模板,用ＰＣＲ技术成功地扩增出我国伪狂犬病毒地方株的ＰＫ基因,并将它克隆于ｐＵＣ１９载体。酶切分析结果表明,所获ＰＫ基因克隆在ＰｓｔＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ和ＳａｌＩ上的切点与ＰＲＶＮＩＡ－３株相同。为下一步进行ＰＫ基因的体外缺失和重组,以构建减毒的ＰＫ缺失疫苗株奠定了基础。     

猪垂体中猪生长激素基因的克隆和部分序列分析

从猪垂体中提取出DNA,以EMBL3噬菌体作裁体,构建了染色体基因文库。用全长的猪生长激素(pGH)cDNA作探针,经原位杂交,筛选出5个阳性克隆。提取其中一个阳性克隆的DNA,通过斑点杂交,酶解和Southern印迹,表明它含有全长猪生长激素基园,将sma Ⅰ酶解后soufhem印迹为阳性的两个片段进行了亚克隆,对其中含有猪生长激素基因sma Ⅰ位点上游序列的片段进行了部分序列分析,并和已发表的相应序列进行了比较。     

虹鳟鱼金属硫蛋白启动子的体外扩增、克隆及其序列分析

以含有虹鳟鱼金属硫蛋白基因的质粒ＤＮＡ为模板,以合成的两段３２个寡聚核苷酸为引物,经过ＰＣＲ扩增,合成了４３３ｂｐ的片段,把其克隆到ｐＢＬ－ＣＡＴ载体中,序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的虹鳟鱼金属硫蛋白启动子含有４３３ｂｐ,含有ＴＡＴＡ和ＣＡＡＴ序列,与Ｈｏｎｇ报导的鳟鱼金属硫蛋白启动子的序列比较,其核苷酸泊同源率为１００％。     

大肠杆菌nhaB基因的克隆及序列分析

采用PCR扩增的方法,从大肠杆菌DH5α中克隆获得了1.5kb的Na^ /H^ 反向运输体DNA片段,经过测序和序列分析,发现该基因片段包含了nhaB基因完事的读码框架。采用DNA序列同源性分析方法,结果显示大肠杆菌DH5α nhaB基因与E.-coliK12 nhaB基因同源性高达99%,与E.coli O157:H7和Shigella flexneri的同源性均为98%,与Salmonella enterica的同源性为79%,表明nhaB基因在细菌中是普遍存在的一种Na^ /H^ 反向运输体基因。nhaB基因与大肠杆菌的耐盐性有着密切的关系,编码的功能性蛋白可能在改良生物耐盐性方面具有重要意义。     

山羊β-乳球蛋白基因5′侧区的克隆、测序和序列分析

采用ＰＣＲ方法,首次从中国山羊肝组织扩增出β乳球蛋白（βＬａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ,βＬＧ）基因的５′侧区８６７ｂｐ片段,其中包括７７０ｂｐ的启动子和９７ｂｐ的部分第一外显子,再克隆测序。然后,我们用计算机分析比较了山羊βＬＧ基因的５′侧区与绵羊的和乳牛的同源性,分别为９４６％和８８％。还发现上述三者该区域中的转录因子结合位点及其序列都很相似。而已知绵羊与乳牛的βＬＧ基因启动子可指导外源基因在转基因动物中组织特异性地高效表达,这提示了山羊βＬＧ基因启动子可能亦足以指导外源基因高效表达。本工作为以后用山羊βＬＧ基因启动子,指导外源基因在转基因动物乳腺中高效表达打下了一定的基础