蚯蚓纤溶酶新基因EfP-0的电子克隆及其编码区序列RT-PCR验证

利用生物信息学手段,以期获得蚯蚓纤溶酶F-Ⅰ-0组分的基因。根据从粉正蚓(Lumbricusrubellus)中分离的F-Ⅰ-0组分的N端氨基酸序列VVGGSDTTIGQYPHQL,利用DNAMAN软件通过电子克隆方法,从Lumbricidae的dbEST中获得该组分的核酸序列信息,设计特异引物,经过RT-PCR,成功地从赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因,命名为EfP-0。EfP-0基因全长678bp,编码225个氨基酸的成熟肽,属丝氨酸蛋白酶,胰蛋白酶家族,与F-Ⅰ-0组分的氨基酸组成非常接近。BLAST证明,EfP-0与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40%,因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因,GenBank登录号为DQ836917。构建的pMAL-c2x-EfP-0重组质粒,在大肠杆菌TB1中获得融合蛋白MBP-EfP-0的可溶性表达,表达产物有酪蛋白平板溶解活性。     

蚯蚓纤溶酶基因的克隆与序列分析

目的:获取蚯蚓纤溶酶(EFE)的基因,并对其进行序列分析。方法:从赤子爱胜蚓中提取总RNA,然后利用RT-PCR技术扩增EFE的基因,并将其插入pUCm-T载体,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果:DNA序列分析表明,所克隆的EFE基因全长为738bp,其中编码区段为735bp,共编码245个氨基酸残基,成熟肽为238个氨基酸残基。与GenBank中已报道的粉正蚓的EFE序列F-Ⅲ-2的同源性最高,两者在核苷酸序列上有2处不同,即第137位(T→C)和第632位(G→T),密码子也因而分别由GTC、GGT变为GCC、GTT,导致第46位、211位的氨基酸残基分别由缬氨酸、甘氨酸变为丙氨酸和缬氨酸。结论:从赤子爱胜蚓中成功克隆了1条EFE基因F245。序列测定及同源性分析表明,蚯蚓纤溶酶F245与已报道的多条EFE基因序列具有高度同源性,且具备完整的编码区。该序列的克隆为用基因工程的方法生产单一成分的高酶活性EFE奠定了基础。     

蚯蚓纤溶酶组分及其基因的多态性

生化制备证明,蚯蚓纤溶酶为一组含有10个以上同工酶组分的混合酶.为了研究这些组分的DNA和蛋白质序列的异同,本文通过对数据库中已报道的28条蚯蚓纤溶酶基因按相似性进行归类,将它们分为4组(基因型).同一组中的序列具有共同特征,即保守的N-末端、C-末端和相同的结构域,而且这些结构域在序列中分布的位置也相同;但它们之间在中间部分存在明显差异,这些差异说明了基因型中存在多态性.这种多态性可能是它们在体内溶栓的药理药效作用存在差异的结构基础.     

蚯蚓纤溶酶新基因PV242的克隆与表达

从我国特有的双胸蚓属（Lumbricus bimastus）蚯蚓体内提取到一种有纤维蛋白平板溶解活性的蛋白质,采用聚偏二氟乙烯膜(PVDF)微量测序法测得蛋白质的N端氨基酸序列,依此设计简并引物,通过RT-PCR获得其对应cDNA.该cDNA全长888 bp,1～726位核苷酸对应读码框架(ORF),编码含242个氨基酸的成熟肽.终止子（TAG）位于cDNA的727～729位,其余核苷酸序列为3′端非编码区.成熟肽命名为蚯蚓纤溶酶PV₂₄₂.蛋白质预测得知蛋白质等电点为4.33,含组氨酸(His44)及丝氨酸 (Ser191)两个活性位点;蛋白质由两个结构域组成,表面有活性裂隙;该蛋白质属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类.经国际基因库等多种查询比较未见PV₂₄₂基因的报道,为首次发现的新基因,在国际基因库的输入号为GenBank AF109648.随后构建了pTrxFUS-PV₂₄₂重组质粒,并在大肠杆菌GI724中获得融合蛋白TrxA/PV₂₄₂的可溶性表达,采用离子交换层析法纯化表达蛋白,融合蛋白有纤维平板溶解活性.     

蚯蚓纤溶酶分子生物学进展

蚯蚓纤溶酶是近年发现的一种新型的溶解血栓物质,属丝氨酸蛋白酶,不同种属的蚯蚓中均可分离到,具纤溶活性和溶栓活性。有较好的热稳定性,多为单体酶,多数兼有纤溶活性和纤溶酶原激活活性。不同种属的蚯蚓分离的纤溶酶性质上有一定差别。已获得多种纤溶酶的N端序列及部分核酸序列,相互之间及与某些蛋白酶之间有一定的同源性。纤溶酶通过降解目的蛋白的特定位点而起作用 。     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定

以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析、Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析以及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ制备电泳等纯化步骤,得到一种纯度达９５％以上的蝗蚓纤溶酶,该酶具有强烈的溶解纤维蛋白折作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为９００ＵＫ单位／毫克蛋白,ＴＡＭＥ法测得其比活性为２５０００单位／毫克蛋白,酶学性质研究表明其最适反应温度为６５     

蚯蚓纤溶酶分子生物学进展

蚯蚓纤溶酶是近年发现的一种新型的溶解血栓物质,属丝氨酸蛋白酶,不同种属的蚯蚓中均可分离到,具纤溶活性和溶栓活性。有较好的热稳定性,多为单体酶,多数兼有纤溶活性和纤溶酶原激活活性。不同种属的蚯蚓分离的纤溶酶性质上有一定差别。已获得多种纤溶酶的N端序列及部分核酸序列,相互之间及与某些蛋白酶之间有一定的同源性。纤溶酶通过降解目的蛋白的特定位点而起作用。     

蚯蚓纤溶酶的成分分析

蚯蚓纤溶酶（ｅａｒｔｈｗｏｒｍｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ,ＥＦＥ）是从蚯蚓体内提取的一类纤维蛋白水解酶,是一种新的溶栓药．利用亲和层析技术,自蚯蚓匀浆液一步提取蚯蚓纤溶酶,并对该酶的成分进行了分析．实验表明,蚯蚓纤溶酶是一组非均一的糖蛋白,含糖量为５％左右,以中性已糖为主;等电点（ｐＩ）在４．０以下;富含Ａｓｐ,而Ｍｅｔ、Ｔｒｐ和Ｌｙｓ含量很少;ｌｍｇ蚯蚓纤溶酶相当于２５０～３００尿激酶单位．     

赤爱胜蚯蚓（EiseniaFoetidaSarigny）纤溶酶的研究：Ⅶ.纤溶酶片释放度的…

本文采用紫外分光光度法对纡溶酶片的释放度进行了测定研究，释放Ｔ５０为４５分钟，释放时间８０分钟，释放量不少于７０％，本测定方法快速简便，适宜生产中控制药品质量，进一步指导生产。     

蚯蚓纤溶酶组分的抗原性

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基 ,通过亲和层析制备出的蚯蚓纤溶酶 (EFE)含有 11～ 13个组分 .为了了解这些组分的相互关系 ,用EFE免疫家兔获得了抗血清 .利用该抗血清与已纯化的 10个组分进行免疫双扩散 ,根据形成沉淀线的形状可以将上述 10个组分分为 4大组 .各组内组分之间的沉淀线完全融合 (免疫反应同一性 ) ;组间沉淀线交叉 (免疫反应非同一性 )或为支线 (免疫反应部分同一性 ) .这种按免疫学性质分组与根据分子量大小、氨基酸组成和N端氨基酸序列分组基本吻合 .上述结果为EFE的分类提供了依据 .     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及性质邢宝东殷慎敏茹炳根（北京大学生命科学学院生物化学及分子生物学系,北京１００８７１）关键词蚯蚓;纤溶酶;纤维蛋白收搞日期：１９９７－０１－２１;接收日期：１９９７－０３－２７。蚯蚓作为中药已有悠久历史,许多中医都把它作为活血药...     

蚯蚓纤溶酶的糖成分分析

以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析制备的蚯蚓纤溶酶是一组糖蛋白。通过苯酚一硫酸法测中性糖,3,5一二硝基水扬酸法测还原糖,硅胶G薄层层析法鉴定糖的种类,结果为：蚯蚓纤溶酶主要含有中性己糖,含量为15％左右,TFMS的去糖处理会使蚯蚓纤溶酶酶活丢失．     

蚯蚓纤溶酶的纯化及稳定性研究

蚯蚓纤溶酶（ＥＰＡ）抽提液经３０％ ～７０％ 饱和度的（ＮＨ４）２ＳＯ４ 盐析、ＤＥＡＥ—纤维素柱层析、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５葡聚糖凝胶过滤等纯化步骤,得到了具有纤溶活性的洗脱峰,置凝胶电泳后,得到四个活性组分,它们经５０℃保温６ｈ,活力上升６４％ ;在２ ｍ ｏｌ／Ｌ盐酸胍存在时,活力仅保存７．２％ ,当其浓度降低时,活力可恢复至９０％ ;在１％ ＳＤＳ存在时,活力仅保存１２．１％ ,但当ＳＤＳ除去时,活力又可恢复。因此,盐酸胍、ＳＤＳ均为ＥＰＡ 可逆性抑制剂。另外,ＥＰＡ 中含有较高的糖链（占总量的４５％ ）,具有良好的抵抗自水解作用。     

蚯蚓纤溶酶组分的分离纯化和分析

通过以大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的亲和层析,从蚯蚓（大平二号, 即赤子爱胜蚓）纯化出的纤溶酶是一组非均一的纤维蛋白水解酶.经DEAE-纤维素离子交换和制备电泳进一步分离纯化,得到12个单一组分. 这些组分的等电点(pI)按照它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱上的顺序从4.0开始依次降低; SDS-PAGE证明, 除3、4外,其余组分均只含一种多肽链,分子质量在22～34 ku之间;用shiff试剂和酚-硫酸染色, 显示1、2、6.5和7是糖蛋白,其中7的糖含量最高; 以BAEE、Chromozym UK和Chromozym PL为底物测定,7的纤溶酶活性最高.     

蚯蚓纤溶酶的分离纯化及部分序列的测定

以新鲜蚯蚓为原料,经过保温抽提、乙醇沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析、Lysine-Sepharose4B亲和层析以及SDS-PAGE制备电泳等纯化步聚,得到一种纯度达95％以上的蚯蚓纤溶酶．该酶具有强烈的溶解纤维蛋白的作用及蛋白酶活性,平板法测得其比活性为90OUK单位／毫克蛋白,TAME法测得其比活性为2500O单位／毫克蛋白．酶学性质研究表明其最适反应温度为65℃,最适反应PH值为8．5．该酶的分子量为33kD,等电点为pH3．5．还对该酶进行了氨基酸组成分析,并测定了其N端部分序列．     

Eisenia fetida中蚯蚓纤溶酶P-Ⅲ组分序列多态性

为了探讨蚯蚓纤溶酶P—Ⅲ组分序列多态性及其与蚓种关系。从Eisenia fetida中提取总RNA,利用P-Ⅲ组分序列两端的保守性设计引物,通过RT—PCR获得P—Ⅲ组分基因,并构建该组分质粒（pUC18）文库,经PCR筛选后进行序列测定及分析。在原已获得的Efp-Ⅲ-1和Efp-Ⅲ-3的基础上,利用中间引物从文库中筛选到Efp-Ⅲ-2基因。序列分析表明,该基因编码序列为720bp,编码239个氨基酸,与GenBank报道的点Efp-Ⅲ-2五条序列整体相似性高达99．02％。通过序列比对,发现Efb-Ⅲ-1、2和3具有完全相同的结构域,差异位点零星分布在序列中间;Lumbricus rubellus的六条序列同样具有Eisenia fetida这个特点,并无明显差异。序列比对证明它们是蚯蚓体内P-Ⅲ组分基因多态性的表现,而且在Lumbricidae科中与蚓种无关。     

蚯蚓纤溶酶底物特异性

蚯蚓纤溶酶是具有较强溶栓作用的丝氨酸蛋白酶,为研究蚯蚓纤溶酶在溶栓的同时是否对其他血液蛋白有破坏作用,本实验以一些血液功能蛋白为底物,用蚯蚓纤溶酶在体外对其进行水解,采用SDS—PAGE检测水解前后底物成分的变化。结果显示,蚯蚓纤溶酶短时间内能完全水解纤维蛋白和纤维蛋白原,长时间作用下能部分水解牛血清白蛋白和人免疫球蛋白重链,不水解牛血红蛋白、牛血超氧化物歧化酶和牛凝血酶原。表明蚯蚓纤溶酶对血栓成分具有较强的识别和水解能力,而对其他血液蛋白作用微弱,说明蚯蚓纤溶酶作为药物使用时具有较强的溶栓和预防血栓形成的作用,且副作用较小。     

赤爱胜蚯蚓(Eisenia Foetida Sarigny)纤溶酶的研究Ⅱ药理学作用

对蚯蚓纤溶酶进行了哈白兔体内、体外溶栓、抗凝试验,分别以蛇毒抗栓酶和尿激酶不同剂量组作对照试验,均有显著的溶解血栓功能.另外,蚯蚓纤溶酶溶解天然血块,对纤维蛋白原含量及凝血时间影响的药理学试验,结果证明蚯蚓纤溶酶具有溶栓与抗凝作用.     

蚯蚓纤溶酶基因（Efp-Ⅰ）在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme,EFE）基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因（GenBank,DQ418454）。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白（MBP-EfP-Ⅰ）。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。     

蚯蚓纤溶酶基因（Efp-Ⅰ）在大肠杆菌中的克隆、表达及活性分析

从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme,EFE）基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-Ⅰ在N-端具有较高的相似性。根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)获得一个完整的基因（GenBank,DQ418454）。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-Ⅰ的N-末端的氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族;不同的是,该基因编码蛋白质的序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-Ⅰ中的一个新基因。在此基础上,构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-Ⅰ,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-Ⅰ的抗原特异性,是MBP和EfP-Ⅰ的融合蛋白（MBP-EfP-Ⅰ）。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-Ⅰ,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。