枯草芽孢杆菌HS-A38高产抗菌肽突变株的筛选及其抑菌机理的研究

本研究通过采用多种诱变方法以提高枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌肽能力,并研究诱变株产抗菌肽活性物质对副溶血弧菌的抑制作用机理。原始菌株经过多种复合诱变后,最终获得一株抗菌活性明显提高的诱变菌株(mut HS-301)。进一步研究采用双倍稀释法确定最低抑菌浓度,并通过扫描电镜观察、胞膜通透性和胞膜完整性的测定,初步阐述该抗菌肽的抑菌机理。结果表明:诱变菌株mut HS-301对副溶血弧菌的抑菌活性较原始菌株提高了20%;抗菌肽成品对副溶血弧菌的最低抑菌浓度为0.625 mg/m L;抗菌肽破坏了菌体细胞的形态,出现形变;随着抗菌肽作用时间的增加,胞外紫外吸收物质和胞外蛋白含量明显增加,说明抗菌肽影响了副溶血弧菌细胞膜的通透性,其胞膜的完整性遭到破坏,影响其代谢活性,从而抑制副溶血弧菌的生长。该研究表明,微生物产抗菌肽主要作用于细菌细胞膜,该产品适宜添加到水产动物养殖饲料中,对提高水产动物免疫力和预防疾病起重要作用。     

一株产淀粉酶芽胞杆菌SY200的鉴定及其对动物病原菌的生物拮抗试验

目的对一株产淀粉酶芽胞杆菌SY200进行鉴定及其对动物病原菌的生物拮抗试验。方法提取芽胞杆菌SY200基因组DNA,采用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增及对扩增到的目标片段的测序,将测序结果与NCBI上已知菌种的16S rRNA序列进行BLAST对比,并构建系统进化树进行分析。采用滤纸片法和牛津杯法分别研究该芽胞杆菌的全菌液及培养物上清液对3株病原菌的生物拮抗。结果结合细菌形态观察及生理生化特性鉴定,最终确定菌株SY200为甲基营养型芽胞杆菌(Bacillus methylotrophicus);芽胞杆菌SY200全菌培养液和培养上清液对产肠毒素大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、金黄色葡萄球菌均有较强的生物拮抗作用,抑菌物质主要为细菌的代谢产物。结论芽胞杆菌SY200被鉴定为甲基营养型芽胞杆菌,该菌株对3株动物性病原菌具有较强的生物拮抗作用。     

一株解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其抑菌条件研究

旨在从海洋环境中分离筛选抑制鲈鱼病原鳗弧菌的拮抗菌,进行菌种鉴定,并对其抑菌条件及药物敏感性进行研究。采用十字交叉划线法和平板点种法筛选鲈鱼病原鳗弧菌的拮抗菌,采用形态学、生理生化反应及16S r DNA基因序列的系统发育分析方法对分离拮抗菌进行鉴定,采用单因子变量法对拮抗菌WTD的最佳抑菌条件进行研究,采用平板药敏纸片法对其药物敏感性进行研究。结果显示,从海洋环境样品中分离出126株细菌,筛选出19株拮抗菌。其中菌株WTD的拮抗效果最强,细菌鉴定结果表明,该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。最佳抑菌条件研究表明,该菌在温度35℃、p H7、盐度为1%Na Cl的时候,拮抗效果最好。药敏实验结果表明,该菌对麦迪霉素等29种抗生素敏感,而对多粘菌素具有抗性。拮抗菌解淀粉芽孢杆菌WTD对鲈鱼病原菌鳗弧菌有较强的抑制作用,具有潜在的应用价值。     

海洋短小枯草芽胞杆菌的鉴定及抑菌活性分析

对从连云港东西连岛海泥样品中分离得到的菌株Bacillus pumilus HX2-2的分类地位、生长条件和抑菌活性进行了研究。经过形态特征、生理生化性质及16S r DNA序列分析鉴定,该菌属于短小芽胞杆菌。不同温度、盐度、pH培养条件下测定菌液吸光度OD600值,表明该菌是一株轻度嗜盐菌,最适温度、盐度、pH分别为30℃、3%、7.0~8.0。在不同病原真菌的平板抑菌活性试验中,该菌对草莓尖胞镰刀菌、马铃薯炭疽病菌和水稻立枯丝核菌表现出显著的抑菌作用。菌株B.pumilus HX2-2是一株短小芽胞杆菌,具有广谱抑菌活性,具有进一步研究的价值。     

苏云金芽胞杆菌LTS290菌株抑制镰孢菌的作用

旨在扩大苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的生防范围,通过对Bt LTS290菌株的对峙培养和菌株无菌发酵液对镰孢菌的抑制作用进行研究。结果表明,Bt LTS290菌株可抑制6种马铃薯致病镰孢菌的生长,并且Bt LTS290无菌发酵液的抑菌效果显著。抑菌物质对温度不敏感,经过121℃处理20 min后仍然具有抑菌活性。在p H3-11范围内存放12 h后,抑菌活性变幅不大,并且用蛋白酶K处理后其抑菌活性依然存在。实验证明苏云金芽胞杆菌Bt LTS290是一株可以高效抑制马铃薯致病镰孢菌的生防菌株。     

水产源芽胞杆菌的分离鉴定及生物学功能分析

筛选具有较好生物学功能的芽胞杆菌(Bacillus),用以改善池塘养殖过程饲料等有机物降解、抑制水体中的病原菌,对从健康养殖鱼虾塘水体中分离的菌株,进行生化试验和16S rDNA序列分子鉴定;通过产酶、耐酸、耐高温试验,抑菌试验以及安全性试验研究分离菌株的生物学功能。试验共筛选出8株细菌,经生化试验及16S rDNA序列的分子鉴定,确定菌株ZHX17、ZHX18、ZHX31为贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）,菌株ZHX14、ZHX15为地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、菌株NSX4、NSX7、NSX9为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。试验结果表明,8株芽胞杆菌均具有较强的耐酸、耐高温特性,其中3株贝莱斯芽胞杆菌具有较强的分泌淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶的能力,抑菌效果好于其他5株芽胞杆菌。安全性试验结果表明,8株芽胞杆菌对草鱼、罗非鱼相对安全。8株芽胞杆菌同时具备分泌淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶3种胞外酶的能力,其中贝莱斯芽胞杆菌具有较强的病原菌抑菌能力,可以作为病原拮抗益生菌做进一步研究。     

苏云金芽胞杆菌抗菌脂肽初步鉴定及抑菌活性测定

植物枯萎病是影响作物生长的重要因素，利用植物内生菌拮抗病原菌生长，从而降低其危害程度是目前研究的热点。本研究从健康的番茄植株中筛选分离得到一株对番茄枯萎病病原菌有较强拮抗作用的内生细菌B-R1,通过形态学、生理生化以及分子生物学检测分析，鉴定该菌株为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。为进一步探索该菌株的生防作用，首先将菌株发酵后离心，得到发酵上清液，采用盐酸沉淀法对其活性物质进行粗提，并检测其对大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌活性。通过薄层色谱法(TLC)、傅里叶红外光谱(FI-TR)、高分辨液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)分析并鉴定活性物质的结构。结果表明，苏云金芽胞杆菌对尖胞镰刀菌有良好的抑制作用，结构分析初步鉴定抗菌物质中含有丰原素(fengycin),属于脂肽类抗生素。     

鸡源益生芽胞杆菌的筛选

根据菌体对低pH和高胆盐的耐受性、产酶特性和对病原菌的抑菌效果,对家鸡肠道中的芽胞杆菌进行了筛选。结果表明,有4株芽胞杆菌(A2、C5、C19和D8)能抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生长。这4株菌在pH 3.0和高胆盐条件下的存活率都达到60%以上,产淀粉酶和蛋白酶的能力也较好,表明这些菌株具有作为益生菌的开发潜力。经形态学和生理生化反应鉴定,初步确定A2和D8为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniform is),C5和C19为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB, 常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种, 弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98%, 相互间不能区分; HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98%以上, 而与所有其它弧菌的相似性不到92%。结合表型和分子特征的鉴定结果, 菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB,常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种,弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌（Vibrioatginolyticus）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98％,相互间不能区分;HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98％以上,而与所有其它弧菌的相似性不到92％。结合表型和分子特征的鉴定结果,菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。