大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

大肠杆菌表达的重组细胞色素P-450nor的分离纯化

用DE－52纤维素柱色谱法和FPLC法（fastProteinliquidchromatography）分离纯化了大肠杆菌表达的重组缣孢菌细胞色素P－450nor（recombinant　fusariumoxvsporumcytochromeP－450nor,rF．P－450nor）．经梯度洗脱MonoQ纯化后的rF．P－450nor为单一色谱峰,比活达55．20U／mg,纯化倍数约为1100倍,SDSPAGE检测为单一谱带．     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CS…

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）的工程菌表达产物进行纯化,经过超声破碎,包涵体抽提,凝胶层析,复性,离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达９８％,比活性达１０００００００ｕ／ｍｇ。     

大肠杆菌表达的重组细胞色素P—450nor的分离纯化

用ＤＥ－５２纤维素柱色谱法和ＦＰＬＣ法分离纯化了大肠杆菌表达的重组缣孢菌色素Ｐ－４５０ｎｏｒ，经梯度洗脱ＭｏｎｏＱ纯化后的ｆＲ．Ｐ－４５０ｎｏｒ为单一色谱峰，比活达５５．２０Ｕ／ｍｇ、纯化倍数约为１１００倍，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测为单一谱带。     

人γ－干扰素生产工艺的研究

采用高密度发酵法发酵重组人γ－干扰素产生菌SW－INF／DH5α并成功地获得高表达、高产量的菌体,表达的γ－干扰素蛋白占菌体总蛋白的60％以上,20L发酵液可收获2kg(湿重)菌体。纯化过程中采用尿素抽提、稀释、复性、浓缩后通过Sephacryl S-200柱的纯化方法。简化了纯化步骤,缩短周期,提高了蛋白回收率。纯化中来采用单抗亲和层析技术,使产品更为安全可靠。最终产品经SDS－PAGE检测纯度达100％,核酸含量和热原均合格,A280／A260>1．5．比活性达1×10⁷IU／mg,总回收率达40％。这说明整个工艺适宜大规模生产的需要,具有实际应用价值。     

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在大肠杆菌中的高效表达及快速纯化工艺的建立

基因工程重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）主要用于癌症患者化疗后的粒细胞减少症．在正确克隆人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的基础上,重点对Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ的５′端进行了较为彻底的修饰,修饰后的基因插入ｐＢＶ２２０载体组建成功ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ／２－１７４高效表达载体．表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析其表达最高达５０％以上．根据Ｇ－ＣＳＦ表达形成包涵体这一特性,建立了一条简便、稳定,适用于大规模生产的分离纯化工艺流程．首先分离纯化包涵体,８ｍｏｌ／Ｌ尿素裂解包涵体,稀释复性蛋白,之后一步ＳＰ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层析至均质．纯化的Ｇ－ＣＳＦ比活性达３．４×１０８Ｕ／ｍｇ蛋白,每升表达菌液回收的Ｇ－ＣＳＦ总活性达１．０６×１０１１Ｕ．纯化产物的Ｎ－端氨基酸序列分析表明,对甲硫氨酸的去除彻底,用于人体时可能具有较小的免疫原性和毒性     

精制狂犬病疫苗纯化方法的比较研究

地鼠肾细胞狂犬病疫苗原液经１００ ｋＤ 膜浓缩 ３０ 倍,分别选用（１）ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ离子交换层析法;（２）Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ－２００ ＨＲ 分子筛选层析法;（３）二次蔗糖等密度区带离心法对其进行纯化。用此三种方法各试制３ 批精制疫苗,结果表明,经ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ离子交换层析纯化后疫苗总蛋白含量减少９９％ 以上,抗原比活性提高１５９ 倍,抗原回收率达５０％ ,纯化疫苗以ＮＩＨ 法效力测定平均为５．４ ＩＵ／２ｍ ｌ;经Ｓｅｐｈａｃｒｙ１ Ｓ－２００ＨＲ 分子筛层析纯化后疫苗总蛋白含量减少 ９８％ 以上,抗原比活性提高４１ 倍,抗原回收率达６３％ ,纯化疫苗效力平均为６．２５ ＩＵ／２ｍ ｌ;经一次蔗糖等密度区带离心法纯化后疫苗总蛋白含量减少９８％ 以上,抗原比活性提高３２１ 倍,抗原回收率达４３％ ,纯化疫苗效力平均为６．１８ ＩＵ／２ｍ ｌ,三种纯化疫苗均符合Ｗ ＨＯ 规程要求。     

重组葡激酶的分离纯化

在构建出高表达,高活性的葡激酶工程菌株的基础上,对表达产物进行了分离纯化研究。经离子交换纯化后,纯度达８５％－９０％,回收率为５０％－６０％,经凝胶过滤后,纯度达９９％以上,回收率为６０％,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定,相对分子质量为１５．５＊１０＾３,比活为１．０＊１０＾５,Ｎ端氨基酸序列与献报道的相符。     

猪肺源肝素的分离纯化及其成分鉴定

本文报告了从猪肺中用改进后的碱性氯化钠盐解法萃取的粗肝素为原料,以新型分离材料ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ分离纯化,并与ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０进行比较,前者使粗肝素比活由１３．９ＵＳＰ／ｍｇ提高到２０３．６４ＵＳＰ／ｍｇ（美国药典单位）,纯化系数达到１４．６５,回收率达８６．９３％,而通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０分离纯化后的肺肝素其比活性提高到１０２．１０ＵＳＰ／ｍｇ,纯化系数为７．３５,回收率为７２．２２％,其比活性、总活性回收率及纯化系数等,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ均优于ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０。纯化相当量粗肝素所需时间、次数亦大大减少,并用醋酸纤维薄膜电泳,高效液相色谱进行性质和纯化鉴定,用红外光谱进行基团分析鉴定。     

疏水层析纯化人重组白细胞介素－4

应用疏水层析对大肠杆菌表达的人重组白细胞介素－４（ｒｈＩＬ－４）进行了纯化,含有ｒｈＩＬ－４的包涵体,经洗涤、变性、复性后,以Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ层析,得到了高纯度的ｒｈＩＬ－４．纯度达９７％;回收率为３２％;比活性为２×１０~７Ｕ／ｍｇ,讨论了ｒｈＩＬ－４疏水层析的条件,并对不同的方法纯化白细胞介素－４进行了比较．     

四种野生盐生植物解剖结构与抗旱耐盐性

为了解盐生植物的解剖结构与抗盐性和抗旱性的关系,以二色补血草、草木樨,艾蒿、猪毛菜为材料,通过徒手切片和显微观察了植物的叶、茎、腺毛、分泌腔、气孔、表皮毛分布和结构。结果显示:猪毛菜的气孔密度低、气孔器小,表皮毛密集,叶面积小,抗旱能力最强;艾蒿的表皮毛长、浓密,气孔密度较低、气孔较小,抗旱性较强;二色补血草表皮毛短、密集,但气孔密度较高、气孔器较大,抗旱性较差;草木樨表皮毛短、稀疏,气孔密度较高、气孔也较大,抗旱性最差;二色补血草有发达的内分泌和外分泌组织,根系吸收的大量盐份积累在分泌腔中,并通过盐腺排出叶片,是排盐植物,耐盐性强;猪毛菜具有发达的内分泌组织,有大量分泌腔,且有粘液细胞和大量薄壁细胞,是耐盐植物,耐盐性强;草木樨具有较多的盐腺,是泌盐植物,耐盐性较强;艾蒿无盐腺等分泌组织。猪毛菜可以作为盐碱地"生物脱盐器"。     

一株产乙酰酯酶细菌筛选、鉴定及酶学性质研究

【目的】利用筛选培养基,从肉牛瘤胃液中分离筛选产乙酰酯酶的细菌菌株,并研究菌株的产酶特征。【方法】利用厌氧培养技术,以木质素为唯一碳源,筛选并驯化所得菌株。根据菌株16S rDNA序列分析、革兰氏染色、伊红美蓝培养基培养、甲基红试验和柠檬酸盐利用试验,鉴定菌株。采用对-硝基苯乙酯测定酶活力。【结果】筛选得到产乙酰酯酶活力较高细菌菌株RB1,初步鉴定为Escherichia coli。菌株RB1的生长曲线表明,0 42 h为菌株的延迟期,42 60 h为菌株的对数期,60 66 h为菌株的稳定期,66 86 h为菌株的衰亡期。菌株所产乙酰酯酶最适温度为40°C,最适pH为8.0,在最适温度与pH条件下,培养基中添加玉米秸秆粉,乙酰酯酶最高酶活力达到0.52 U/mL。【结论】筛选获得产乙酰酯酶的细菌菌株RB1,其乙酰酯酶活力高于已报道的菌株,是一株具有研究和应用潜力的产乙酰酯酶的菌株。     

Fe3+络合萃取法从野葛根中分离葛根素

利用Fe3 + 能够和葛根素生成可溶性络合物的性质建立了一种从中药野葛根中萃取葛根素的新型分离方法。以甲醇冷浸从野葛根中提取葛根总黄酮 ,将其进行水解、中和 ,再给水解葛根总黄酮中加入FeCl3 使葛根素与Fe3 + 络合溶解 ,过滤除去其它不溶性物质 ,用盐酸解聚Fe3 + 葛根素络合物 ,则得葛根素粗品 ,将其重结晶可得葛根素。同时 ,利用分光光度法确定了Fe3 + 葛根素络合物解聚的最佳酸度。利用TLC标准品对照、IR和分光光度法对产品进行了定性和定量分析。该方法从葛根中提取葛根素收率为 1 2 % ,纯度为 96 5 % ,具有操作简便、工艺流程简单 ,容易实现工业化的优点。     

海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。     

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的高效组装技术研究*

目的:探索猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLPs)的高效组装技术,提高VLPs的稳定性。方法:利用大肠杆菌表达PCV2 Cap蛋白自组装为VLPs,分析不同离子强度下VLPs的稳定性。利用切向流技术添加尿素,降低pH,可使VLPs解组装,利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析纯化获得Cap蛋白,去除尿素,提高离子强度和pH,实现VLPs的高效再组装。结果:PCV2 Cap蛋白自组装VLPs在150mmol/L NaCl下稳定性较差,而在500mmol/L NaCl下可提高VLPs的稳定性,但仍较易发生聚集,核酸含量均较高。在150mmol/L NaCl、300mmol/L尿素和pH 5.5的缓冲体系条件下,能够使VLPs解组装。经25%~50%饱和硫酸铵(V/V)分级沉淀粗纯,阴离子交换层析500mmol/L NaCl下洗脱获得精纯Cap蛋白,蛋白质纯度≥95%,并能够有效去除核酸。通过切向流技术去除体系中的尿素,并将NaCl浓度提高至1mol/L、pH提高至8.0,改变蛋白质表面静电荷分布,实现VLPs的高效、均一再组装,组装效率≥99%,回收率为65.85%,并明显提高VLPs的稳定性,能够稳定保存6个月以上。结论:利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析纯化获得Cap蛋白,去除尿素,提高离子强度和pH,实现VLPs的高效再组装。     

中国林蛙变态蝌蚪对pH、盐度和碱度的适应性

在水温16～18℃的野外条件下,采用单因子急性毒性实验法,研究了水环境中pH、盐度和碱度对中国林蛙(Rana chensinensis)变态蝌蚪的毒性效应．结果表明,中国林蛙变态蝌蚪对pH的适应范围为4．3～9．7,最低耐受限3．6,最高耐受限10．7;对盐度的最高耐受限为9．98g·L^-1,适应盐度上限7．14g·L^-1,安全盐度上限1．70g·L^-1;对碱度的最高耐受限为19．96mmol·L^-1,适应碱度上限8．76mmol·L^-1。安全碱度上限2．41mmol·L^-1．野外变态蝌蚪饲养池水体pH应控制在6．5～8．5,盐度控制在2．0g·L^-1以下,碱度不超过4．0mmol·L^-1．中国林蛙变态蝌蚪是一种狭酸碱、低耐盐、低耐碱生物。     

青蛤的营养成分分析与评价

测定了61、2月份青蛤(Cyclina sinensis)的营养成份,并对其营养价值进行综合评定。结果表明,6月份青蛤的营养较12月份好,其粗蛋白比12月的高出2.84%,粗脂肪含量高出1.74%;6月和12月的氨基酸总含量分别为826.3 mg/g蛋白质和804.0 mg/g蛋白质,其中必需氨基酸分别占36.1%和33.6%,氨基酸计分(AAS)和化学评分(CS)是6月的较高,必需氨基酸指数(EAAI)则分别为64.23和59.88。其不饱和脂肪酸占脂质总量的67.7%,其中单烯酸占24.9%,多烯酸占42.8%,“脑黄金”DHA和EPA的含量分别达到11.3%和18.4%。还含有多种微量元素和维生素。     

基于景观尺度下的鄱阳湖湿地浅层土有机碳的空间特征

湿地土壤有机碳研究是全球碳循环研究的基础性工作, 对于准确评估湿地固碳增汇和全球温室气体减排都具有重要意义。以鄱阳湖国家自然保护区为研究区域, 选择六种景观类型(湿地洲滩景观包括受人工控制的碟形湖泊常湖池、半人工控制的碟形湖泊蚌湖、不受人工控制的洲滩前缘泗洲头以及岗地景观包括林地、田地和菜地), 湿地洲滩景观在各1 m高程(泗洲头和蚌湖采样高程10-17 m, 常湖池采样高程12-17 m)内的浅土壤采取3个土壤样品, 岗地景观浅层土壤各采取3个土壤样品, 分析浅层土壤有机碳含量。结果表明, 鄱阳湖不同景观类型的浅层土壤有机碳含量差异性显著。湿地洲滩浅层土壤(特别是0-10 cm土层)的有机碳随高程梯度变化呈现倒U型变化, 即低海拔与高海拔土壤有机碳的含量较中海拔土壤有机碳的含量低, 泗洲头洲滩土层0-10 cm的有机碳含量最高值出现在13-14 m高程, 其中0-10 cm土层的土壤有机碳含量变化值为1.56-12.29 g·kg-1, 10-20 cm土层的土壤有机碳含量变化值为0.96-8.19 g·kg-1; 蚌湖洲滩土层0-10 cm的有机碳含量最高值出现在14-15 m高程, 其中0-10 cm土层的土壤有机碳含量变化值为6.36-23.32 g·kg-1, 10-20 cm土层的土壤有机碳含量变化值为4.14-8.88 g·kg-1; 常湖池洲滩土层0-10 cm的有机碳含量最高值出现在16-17 m高程, 其中0-10 cm土层的土壤有机碳含量变化值为6.51-18.91 g·kg-1, 10-20 cm土层的土壤有机碳含量变化值为3.83-10.05 g·kg-1。岗地浅层土壤有机碳(特别是0-10 cm土层)田地的土壤有机碳含量最高, 菜地土壤有机碳含量最低。比较六种景观类型的浅层土壤有机碳含量, 泗洲头洲滩浅层土壤有机碳含量最低, 蚌湖洲滩浅层土壤有机碳含量最高。六种景观类型的浅层土壤有机碳含量呈现一致的现象是土层0-10 cm的机碳含量明显高于土层10-20 cm的有机碳含量, 说明鄱阳湖国家自然保护区内土壤有机碳含量主要富集在土壤浅层的特征。土壤pH值对湿地土壤有机碳呈显著负相关性, 而土壤含水量、地上部分生物量与土壤有机碳呈显著正相关性。     

Regulation of beta-glucosidase in Bacteroides ruminicola by a different mechanism: growth rate-dependent derepression

Bacteroides ruminicola B(1)4, a predominant ruminal and cecal bacterium, was grown in batch and continuous cultures, and beta-glucosidase activity was measured by following the hydrolysis of p-nitrophenyl-beta-glucopyranoside. Specific activity was high when the bacterium was grown in batch cultures containing cellobiose, mannose, or lactose (greater than 286 U/g of protein). Activity was reduced approximately 90% when the organism was grown on glucose, sucrose, fructose, maltose, or arabinose. The specific activity of cells fermenting glucose was initially low but increased as glucose was depleted. When glucose was added to cultures growing on cellobiose, beta-glucosidase synthesis ceased immediately. Catabolite repression by glucose was not accompanied by diauxic growth and was not relieved by cyclic AMP. Since glucose-grown cultures eventually exhibited high beta-glucosidase activity, cellobiose was not needed as an inducer. Catabolite repression explained beta-glucosidase activity of batch cultures and high-dilution-rate chemostats where glucose accumulated, but it could not account for activity at slow dilution rates. Maximal beta-glucosidase activity was observed at a dilution rate of approximately 0.35 h-1, and cellobiose-limited chemostats showed a 15-fold decrease in activity as the dilution rate declined. An eightfold decline was observed in glucose-limited chemostats. Since inducer availability was not a confounding factor in glucose-limited chemostats, the growth rate-dependent derepression could not be explained by other mechanisms.     

Regulation of beta-glucosidase in Bacteroides ruminicola by a different mechanism: growth rate-dependent derepression.

Bacteroides ruminicola B(1)4, a predominant ruminal and cecal bacterium, was grown in batch and continuous cultures, and beta-glucosidase activity was measured by following the hydrolysis of p-nitrophenyl-beta-glucopyranoside. Specific activity was high when the bacterium was grown in batch cultures containing cellobiose, mannose, or lactose (greater than 286 U/g of protein). Activity was reduced approximately 90% when the organism was grown on glucose, sucrose, fructose, maltose, or arabinose. The specific activity of cells fermenting glucose was initially low but increased as glucose was depleted. When glucose was added to cultures growing on cellobiose, beta-glucosidase synthesis ceased immediately. Catabolite repression by glucose was not accompanied by diauxic growth and was not relieved by cyclic AMP. Since glucose-grown cultures eventually exhibited high beta-glucosidase activity, cellobiose was not needed as an inducer. Catabolite repression explained beta-glucosidase activity of batch cultures and high-dilution-rate chemostats where glucose accumulated, but it could not account for activity at slow dilution rates. Maximal beta-glucosidase activity was observed at a dilution rate of approximately 0.35 h-1, and cellobiose-limited chemostats showed a 15-fold decrease in activity as the dilution rate declined. An eightfold decline was observed in glucose-limited chemostats. Since inducer availability was not a confounding factor in glucose-limited chemostats, the growth rate-dependent derepression could not be explained by other mechanisms.