溶瘤I型单纯疱疹病毒的研究进展

溶瘤病毒(Oncolytic virus,OV)是可以靶向感染并杀伤肿瘤细胞的一类病毒,其中溶瘤I型单纯疱疹病毒(Oncolytic herpes simplex virus type 1,OHSV-1)是目前研究最多的溶瘤病毒之一,可通过多种策略进行构建,已有多种OHSV-1进入临床试验,大量结果显示其具有较好的安全性和有效性。本文主要介绍OHSV-1的分子生物学特性与优势、主要的开发及靶向性策略、各类OHSV-1的研究进展以及目前存在的问题等。     

表达小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的重组非复制型痘苗病毒的构建及鉴定

目的:以非复制型痘苗病毒天坛株为载体表达小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),并体外鉴定其生物学活性。方法:构建含有小鼠GM-CSF的重组痘苗病毒质粒,与非复制型痘苗病毒进行同源重组,筛选表达小鼠GM-CSF的重组痘苗病毒rNTVGMCSFLacZ,对目的基因及蛋白的表达进行鉴定,并在体外检测目的蛋白的生物学活性。结果:构建的重组病毒rNTVGMCSFLacZ中正确插入了小鼠GM-CSF基因,Western印迹结果表明其能正确表达GM-CSF,且在体外证明rNTVGMCSFLacZ表达的小鼠GM-CSF能分泌到细胞外,具有生物学活性。结论:构建了一株能分泌表达有生物学活性的小鼠GM-CSF的重组非复制型痘苗病毒。     

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在烟草种子中的表达

TransgenicResearch 2 0 0 2年 1 0月 1 1卷 5期 5 2 1～ 5 31页报道 :种子不仅是高等植物延续生命的重要材料 ,也是人类食物、药品和工业原料的重要来源。近年来已将不同来源包括人类、细菌和病毒的可利用的基因序列表达于植物 ,也试图利用转基因种子蛋白来生产药物。已知人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (GM CSF)在调节白血细胞 (粒细胞和单核细胞 )的生成和功能中可发挥重要作用 ,在抗感染中具有重要的临床意义。还发现GM CSF在化疗、骨髓移植、抗癌和抗艾中也具有多种临床应用。因此 ,目前已有一些国家将重组GM CSF用于临床治疗…     

溶瘤单纯疱疹病毒治疗技术及其进展

溶瘤病毒治疗是当前肿瘤治疗技术的研究热点,溶瘤单纯疱疹病毒是目前研究最多的,也是抗肿瘤作用最好的溶瘤病毒之一,本文就主要介绍溶瘤单纯疱疹病毒的优势、遗传操作、发展策略、研究进展及靶向性策略等。     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

肿瘤抗原致敏的GM-CSF基因转染巨噬细胞对实验性肺转移肿瘤的治疗作用

研究将对巨噬细胞双重功能均具有激活作用的细胞因子GM-CSF的基因转染小鼠腹腔巨噬细胞,再经肿瘤抗原致敏后通过静脉注射用于实验性CT26结肠癌肺转移小鼠的治疗.结果表明,腺病毒介导的GM-CSF基因转染小鼠腹腔巨噬细胞在转染后4h即可分泌较高水平的GM-CSF.转染后10d仍可有效表达;转染后16h左右小鼠腹腔巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达明显增强,其抗原提呈能力也达最高水平;对肿瘤细胞的杀伤活性显著增高;荷瘤3d的实验性CT26结肠癌肺转移小鼠经肿瘤抗原致敏的GM-CSF基因转染巨噬细胞治疗后第16天肺部转移结节数明显减少;经治疗小鼠脾细胞经诱导的CTL杀伤活性也明显升高.以上结果提示,GM-CSF基因转染及表达能有效增强小鼠腹腔巨噬细胞的抗原提呈能力及效应功能;经肿瘤抗原刺激后其对转移性肿瘤也有明显的治疗作用.     

重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标记的非融合蛋白基因转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃ将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因成功地插入病毒ＡｃＮＰＶ的基因组中．ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在感染重组病毒的草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）培养细胞Ｓｆ９中得到表达,感染后的Ｓｆ９细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达２．７×１０５５ＣＦＵ／ｍｌ。以ｈＧＭ－ＣＳＦ单抗所作的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ表明,表达的ｈＧＭ－ＣＳＦ对是３种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为１５ｋｄ,１８ｋｄ和２０ｋｄ。     

重组人粒细-巨噬细胞集落刺激因子在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的:利用毕赤酵母野生型菌株GS115(his4)和突变型菌株GJK01(ura3,adel,arg4,his4,ochl)表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF),并对其活性及糖基修饰情况进行比较.方法:用PCR技术扩增目的基因,引入Xho I、NotⅠ双酶切位点,构建pPIC9-hGM-CSF表达载体,电击转化毕赤酵母GS115和GJK01感受态细胞,得到工程菌;经甲醇诱导,对其表达产物进行糖基分析和生物学活性分析.结果:hGM-CSF在野生型菌株GS115和突变型菌株GJK01中均得到表达,其中野生菌表达的为过度糖基化的糖蛋白,而突变型菌株表达的为低糖化的糖蛋白,且二者均可刺激TF-1细胞的生长,比活性分别为9.79x105和2.21x10s U/mL.结论:利用酵母工程菌表达了低糖化的重组hGM-CSF,为其药物研究提供了新的思路,也为酵母的糖基工程改造提供了良好的糖蛋白模型.     

可复制性单纯疱疹病毒在抗肿瘤方面的应用

单纯疱疹病毒是肿瘤生物治疗中常用的病毒载体之一,可复制性单纯疱疹病毒以其溶瘤效率高、特异性好、可行性强成为近年来研究的热点。其中对溶瘤性单纯疱疹病毒突变株G207的研究开展得早,其溶瘤效果、靶向性及安全性都得到了确认,这也带动了可复制性单疱病毒应用的发展,目前已研究出多种溶瘤单纯疱疹病毒突变株。本文就近几年可复制性单纯疱疹病毒在抗肿瘤方面的研究现状加以综述,以探讨其临床治疗肿瘤的潜在价值及可行性。     

人巨噬细胞集落刺激因子在家蚕中的高效表达

人巨噬细胞集落刺激因子在家蚕中的高效表达秦浚川,邱平,施晓青,朱洁,朱德煦（南京大学生物化学系,国家医药生物技术重点实验室,２１０００８）关键词人巨噬细胞集落刺激因子;家蚕;基因表达人巨噬细胞集落刺激因子（ｈＭ－ＯＳＦ）是一种重要的血细胞生长因子,它...     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

人重组GM—CSF／HSA—D3嵌合蛋白（GM—HSA）在大肠杆菌中的表达及其产…

将人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人血清白蛋白第三功能区（ＨＳＡ－Ｄ３）的基因串联后,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获高效表达,表达量占菌体蛋白的３２．６％。利用ＴＦ－１体外细胞活性测定表明,ＧＭ－ＨＳＡ的活性单位为１．０４×１０＾６Ｕ／ｍｇ,虽然其比活性低于ＧＭ－ＣＳＦ,但比后者具有更高的体外热稳定性和储藏稳定性。     

溶瘤病毒调控肿瘤微环境及联合治疗的研究进展

溶瘤病毒是一类天然的或经改造后获得具有靶向杀伤癌细胞能力的病毒,除了能特异性杀伤肿瘤细胞外,经改造后的溶瘤病毒对肿瘤微环境的调控作用也会影响其最终疗效.通过调控肿瘤微环境中肿瘤细胞抗原的表达、免疫抑制状态、肿瘤相关成纤维细胞及肿瘤血管新生等,溶瘤病毒为肿瘤的治疗提供了更为系统的治疗策略;联合免疫检查点抑制剂的使用能使两者获得协同和互补的功效,进一步提升了肿瘤全面和有效的治疗.本文将对溶瘤病毒对肿瘤微环境调控作用及联合治疗的研究进展进行综述.     

溶瘤痘苗病毒的研究进展

溶瘤病毒可靶向性杀伤肿瘤细胞而不对正常细胞产生杀伤作用。近几年已开发出十余种溶瘤病毒。痘苗病毒曾在全球消灭天花行动中被广泛使用,并且有着复制速度快、免疫原性强、副作用明确等优点。痘苗病毒经过基因改造,可以选择性地在肿瘤细胞中复制并裂解细胞。目前,用于溶瘤痘苗病毒改造的主要有痘苗病毒Western Re verse株、Wyeth株、Lister株和Copenhagen株,我国使用的痘苗病毒天坛株尚未有相关报道。     

失活 ChiA 和 v-cath 基因的重组BmNPV 表达 hGM-CSF

利用 DNA 同源重组技术使家蚕核型多角体病毒的多角体蛋白基因取代 v-cath 、 ChiA 两基因的部分编码区域和共同的启动子区域,获得了 v-cath 、 ChiA 两基因同时失活的、可形成多角体的、并能表达人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子的重组病毒 BmNPVpolh+CP－ChiA－GMCSF+. 研究结果显示： v-cath 、 ChiA 两基因的失活不影响病毒的复制及多角体的形成,但感染细胞的存活时间比野生病毒感染的多 2 天,可明显改善外源基因在培养细胞和家蚕中的表达水平;感染 BmNPV polh+CP－ChiA－GMCSF+的家蚕幼虫体表保持正常,无野生病毒感染后引起的破皮流脓现象 .     

溶瘤腺病毒在肿瘤靶向治疗中的研究进展

溶瘤腺病毒是一组通过基因工程构建的腺病毒、能够选择性在肿瘤细胞中完成感染-复制周期,从而特异性地杀伤、溶解肿瘤而不伤及其他正常细胞、组织,其作用机制包括：通过基因的缺失突变、插入特异性启动子、以及通过病毒结构蛋白的修饰等方面,实现肿瘤靶向治疗作用。本文就相关研究及进展进行综述。     

溶瘤腺病毒在肿瘤靶向治疗中的研究进展

溶瘤腺病毒是一组通过基因工程构建的腺病毒、能够选择性在肿瘤细胞中完成感染-复制周期,从而特异性地杀伤、溶解肿瘤而不伤及其他正常细胞、组织,其作用机制包括:通过基因的缺失突变、插入特异性启动子、以及通过病毒结构蛋白的修饰等方面,实现肿瘤靶向治疗作用。本文就相关研究及进展进行综述。     

大肠杆菌表达的重组人GM-CSF的纯化

本文对重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)高效表达克隆pZW.GM的表达产物进行纯化,并对纯化的人GM-CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM-CSF基因表达产物在大肠肝菌中以不溶性包涵体形式存在,经超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99％,按蛋白总量计算回收率达10％,比活性达1×10~7u/mg蛋白质。通过测定纯化人GM-CSF的N端16个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。