转Bar基因甘蓝型油菜叶片蛋白质组变化的初步分析

采取SDS-PAGE与MALDI-TOF-MS联用的方法,对抗除草剂转Bar基因T1代甘蓝型油菜与普通栽培油菜的叶片蛋白质组进行比较性研究,获得差异蛋白质组的重要信息,并初步探讨差异蛋白的主要功能,以期找到与转Bar基因油菜抗除草剂有关的蛋白质,揭示其抗性机理.双向电泳表达图谱研究表明,Bar基因的转入使得转基因油菜中的差异蛋白表达质与量发生了显著变化,共得到16个发生差异表达的蛋白质点,其中11个经质谱分析功能得到鉴定,这些鉴定出的蛋白质涉及多个生理过程,如能量与代谢、信号转导、代谢相关蛋白离子转运和防御应答等.     

丝瓜果实发育过程的蛋白质差异表达分析

丝瓜果实发育过程伴随着明显的形态转变和复杂的生理生化变化,这些变化均影响着果实的采后寿命和品质。为阐明丝瓜果实发育过程中重要蛋白质的功能与调控作用,该研究以同位素标记相对定量联合液相色谱串联质谱(iTRAQ-LC-MS/MS)技术测定丝瓜果实发育过程三个时期(花后5天、花后15天、花后30天)蛋白的表达水平,鉴定差异蛋白,并对它们进行亚细胞定位、GO(gene oncology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)途径分析。共鉴定到差异蛋白709个,其中在丝瓜果实不同发育时期共同存在的差异蛋白有229个,上调蛋白有118个,下调蛋白由111个。亚细胞定位显示,差异蛋白的亚细胞主要定位于叶绿体、细胞质和细胞核。GO分析发现,四吡咯结合、过氧化物酶活性、氧化还原酶活性、血红素结合和抗氧化活性是差异蛋白5种主要的分子功能,过氧化氢代谢过程、应激反应和防御反应是差异蛋白3种主要参与的生物过程。代谢途径分析显示,丝瓜果实发育过程的差异蛋白主要富集在3个代谢途径,分别为次生代谢产物生物合成、糖代谢和DNA复制途径,从中筛选出36个在丝瓜果实发育过程发挥重要作用的目标差异蛋白。其中, PAL、C4H、4-CL、COMT和CAD可能是调控果实内酚类物质和木质素合成的5种关键蛋白。PAL、POD、PPO、CAT、APX 5种差异蛋白可能协同参与果实发育后期的酶促褐变。SS和α-AL可能在丝瓜果实蔗糖的累积和淀粉的降解过程中起着重要作用。以上研究结果为进一步阐明丝瓜的发育调控,进而指导丝瓜品种选育和生产栽培提供了理论支持。     

双孢蘑菇子实体不同发育时期的转录组分析

双孢蘑菇是世界第一大宗栽培食用菌,具有重要经济价值。为探讨双孢蘑菇子实体不同发育时期基因表达变化,利用高通量测序技术对双孢蘑菇原基期、采收期和开伞后期等不同发育时期进行RNA‐Seq分析,共筛选到6 328个差异表达基因,其中3 941个上调基因,2 387个下调基因。Gene Ontology(GO)功能聚类分析表明,差异表达基因主要富集在结合、催化分子功能组和代谢过程生物学通路中,且发育过程和有性繁殖相关的基因全部为上调表达,以利于细胞分化发育形成成熟子实体进入生殖生长阶段。KEGG功能富集分析结果表明,差异基因参与了氨基酸代谢、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、脂类代谢和能量代谢这五大代谢通路,其中差异基因主要富集在氨基酸代谢通路中,氨基酸合成相关的多数基因上调表达,表明双孢蘑菇子实体发育形成需要一系列代谢反应协同调控,氨基酸代谢相关基因可能在双孢蘑菇子实体发育过程中起重要作用。本文通过全面分析双孢蘑菇子实体发育时期基因表达变化,获得了大量转录本信息,为深入了解双孢蘑菇子实体发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。     

油菜种子发育早期的油体发生与调控

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种‘Westar’和‘Topas’为材料,通过超微结构观察和荧光定量PCR技术对油菜胚胎发育早期油体的发生、油体蛋白及脂肪酸合成转录因子基因的表达情况进行分析。结果显示：油体出现在油菜胚胎发育早期,在授粉9~11 d后（球形胚时期）的胚体和胚柄中均存在直径小于0.5 μm的油体;荧光定量实验结果表明,除BnCLO3的表达量在整个胚胎发育阶段无明显变化外,其他油体蛋白基因Oleosins、Steroleosins和BnCLO1的表达量在心形胚时期就明显增多并持续增长;脂肪酸合成转录因子BnLEC1、BnL1L、BnWRI1和BnFUS3在胚胎发育阶段,基因表达规律均呈先上升再下降的趋势,但达到最高值的时间存在差异,其中BnLEC1最早,BnL1L其次,BnWRI1和BnFUS3较晚。研究结果表明甘蓝型油菜在球形胚时期出现油体,其结构蛋白和转录调控因子基因的表达自心形胚开始明显增多。     

五种不同类型甘蓝型油菜雄性不育系花蕾及雌雄蕊干物质变化动态的比较研究

以5种不同类型甘蓝型油菜雄性不育系为材料,以保持系作对照,对甘蓝型油菜雄性不育系的花蕾及雌雄蕊干物质变化动态进行了研究。结果表明,干物质重量雄性不育系花蕾和雄蕊显著小于保持系,而雌蕊则明显大于保持系。大多数不育系雌雄蕊的发育曲线存在拐点,它们出现拐点的时期相同,但方向完全相反。暗示可能雄蕊败育后降解的生物大分子物质被部分运到了雌蕊,才引起了雌蕊干物重的异常增加。     

mED2-一个小鼠胚胎发育的新基因

克隆参与胚胎发育的新基因并研究其表达规律和功能是揭示胚胎发育的基因调控机理的重要途径。囊胚形成和原肠形成是哺乳动物胚胎发育过程中的两个关键阶段。囊胚阶段发生了胚胎的第一次分化,是细胞多能性和分化的一个转折点。此时涉及的基因活动,既有维持胚胎干细胞全能性或多能性的基因活动,又有按照预定发育模式参与胚胎定向分化的基因活动。原肠期是胚胎发育过程中的第二个关键转折点,涉及到3个胚层的形成和细胞命运决定等多种变化。在这个时期胚胎获得了胎儿原基的所有信息,新组织的产生和细胞迁移的再生组织与形态发生、细胞增殖、细胞分化、模式形成等存在着非常复杂而相互协调的关联。大多数细胞正由原来的多潜能逐渐向寡潜能发展,控制组织器官形态建成的基因正逐渐开启。这两个时期的基因表达图式、特征和种类会有很大的差异和变化,因此研究这两个时期的新基因的表达规律和功能,将是了解胚胎发育的基因调控机理的重要途径。文章以这两个时期胚胎为原始材料,利用减法杂交方法克隆到一新的小鼠胚胎基因mED2,对其进行了表达规律和生物学功能的初步分析。RT-PCR-Southern和原位杂交实验表明,mED2基因转录水平具有发育阶段的依赖性;随着发育过程的进行,其表达主要在胚神经系统和中胚层衍生的组织表达。mED2基因活性的knockdown对于合子的卵裂和植入前早期胚胎发育均有抑制作用。亚细胞定位实验表明,mED2基因编码的蛋白基本定位于细胞核膜及其临近的内膜细胞器（粗糙内质网和高尔基体）。根据生物信息学分析,mED2蛋白可能为一跨膜蛋白且与含有硫氧还蛋白结构域的蛋白有部分匹配。由此推测mED2基因参与了小鼠植入前早期胚胎发育,其基因产物可能通过蛋白之间的相互作用,即对蛋白进行后期修饰、折叠及行使分子伴侣等作用来活化或抑制其靶蛋白的活性,进而参与小鼠的早期胚胎发育。     

甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1编码区全长cDNA 的克隆与表达分析

通过筛选野生型油菜(Pet33-10)与无花瓣油菜(Apet33-10)反向消减文库(SSH)和运用RACE-PCR技术, 获得了甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1的全长编码区 cDNA (GenBank登陆号DQ298446)。该基因长484 bp, 含有一个长354 bp的阅读框。BnSmD1在N端拥有两个高度保守的结构域(Sm-1和Sm-2), 羧基端则含有一个RG重复序列。Northern blot表达结果显示: BnSmD1在甘蓝型油菜的各个组织均有表达, 但是它在早期花蕾中的表达明显高于同期的叶和茎。通过对BnSmD1在Apet33-10无花瓣品系与野生型有花瓣品系Pet33-10中各组织的表达差异进行比较, 发现该基因在Apet33-10的早期花蕾中表达明显下降。因此, BnSmD1可能对植物的早期花发育起到了重要的作用, 并很有可能影响花瓣的形成。     

苜蓿雄性不育植株与可育植株现蕾初期花蕾蛋白质组比较

采用双向凝胶电泳对现蕾初期苜蓿雄性不育植株(Ms-4)及其可育植株(MF)花蕾蛋白质进行了分离,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。通过ImageMaster 2D软件对Ms-4和MF银染图谱分析发现,两者在等电点5~7、分子量20~60 kD范围内蛋白质斑点分布最多,可识别的总蛋白质点数均在6 000个左右,其中差异表达的蛋白质点数为98个;进一步通过质谱分析成功鉴定了22个差异蛋白点。利用Blast2GO程序对 22个蛋白点进行功能注释和代谢途径分析发现,核酮糖羧化酶小亚基、尿苷三磷酸-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶等蛋白在光合作用、碳水化合物代谢、多细胞生物有机体的发育等过程中起着重要的作用,同时参与了细胞质、细胞壁等组成,并具有绑定、催化、结合和水解等功能。研究结果初步推断,在苜蓿花药发育过程中,蛋白的缺失及表达量的变化可能会使与花粉发育有关的能量缺失,物质合成发生改变,导致雄性不育。     

油菜种子发育早期的油体发生与调控

以甘蓝型油菜( Brassica napus L.)品种‘Westar’和‘Topas’为材料,通过超微结构观察和荧光定量PCR技术对油菜胚胎发育早期油体的发生、油体蛋白及脂肪酸合成转录因子基因的表达情况进行分析。结果显示:油体出现在油菜胚胎发育早期,在授粉9 ~ 11 d后(球形胚时期)的胚体和胚柄中均存在直径小于0. 5 μm的油体;荧光定量实验结果表明,除 BnCLO3 的表达量在整个胚胎发育阶段无明显变化外,其他油体蛋白基因 Oleosins 、 Steroleosins 和 BnCLO1 的表达量在心形胚时期就明显增多并持续增长;脂肪酸合成转录因子 BnLEC1 、 BnL1L 、 BnWRI1 和 BnFUS3 在胚胎发育阶段,基因表达规律均呈先上升再下降的趋势,但达到最高值的时间存在差异,其中 BnLEC1 最早, BnL1L 其次, BnWRI1 和 BnFUS3 较晚。研究结果表明甘蓝型油菜在球形胚时期出现油体,其结构蛋白和转录调控因子基因的表达自心形胚开始明显增多。     

应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因

以甘蓝型油菜(Brassica napus)野生型(宁油10号)及其柱头授粉功能缺失突变体FS-M1为材料,使用油菜基因表达谱芯片筛选甘蓝型油菜柱头特异表达基因。在含有16 540个基因的油菜基因表达谱芯片中(43 803探针),获得了4 410条差异表达探针,选择部分差异表达基因进行实时定量PCR,所得结果与芯片检测结果相吻合。其中,野生型较FS-M1显著上调且获得209个功能注释的探针,对应198个基因,这些特异表达的基因主要富集在水解酶、转移酶、氧化还原酶和转录因子中;涉及较大的基因家族包括:细胞色素P450基因、GDSL脂肪酶/水解酶基因、ABC转运蛋白基因、myb转录因子基因、bHLH转录因子基因、过氧化物酶家族和受体激酶基因等。推测这些基因与甘蓝型油菜柱头发育及授粉功能有关。     

陆地棉‘徐州142’纤维不同发育时期蛋白质组比较分析

该研究以陆地棉‘徐州142’为材料,于开花后5、10、15、20、25、30d分别取样(棉铃)代表6个不同时期的棉纤维,利用双向电泳技术比较了棉纤维发育不同时期蛋白质组的变化,以明确不同发育阶段差异表达蛋白质及其功能与纤维发育之间的关系,为棉花产量和品质的改良提供理论依据。结果显示:(1)随着棉花的发育,棉纤维中的总蛋白含量逐渐降低,在开花后5d(5DPA)时棉花纤维中总蛋白的含量最高,达到11.7%,同时2-DE图谱中发现了15个明显的差异蛋白点;(2)运用MALDI-TOF-MS对差异蛋白质点鉴定结果发现,有5个明显的差异蛋白与棉花纤维发育相关,分别是GhSAM、GhPGK、GhCSD、GhFB和GhMDH蛋白;(3)开花后不同时期棉纤维蛋白质组的2-DE图谱表明,GhSAM、GhPGK1和GhMDH 3个蛋白在整个发育期都表达,但GhCSD从15DPA开始表达,GhFB从20DPA开始表达,而且GhSAM在15DPA时蛋白表达量最高,GhPGK1在10DPA时表达量最高,GhMDH、GhCSD和GhFB都是在30DPA时表达量最高。研究表明,棉纤维发育不同时期存在着差异蛋白,且在纤维发育不同时期蛋白的表达量也存在差异,同时这些差异蛋白参与能量代谢、碳代谢、细胞周期调控和发育等途径。     

应用蛋白质组学技术筛选胃癌SGC-7901细胞中的let-7a功能相关蛋白

为探讨let-7a表达下调在胃癌发病中的机制,高通量地检测了与let-7a功能相关的蛋白质.首先采用基因克隆技术稳定过表达SGC-7901细胞系的let-7a基因,然后用蛋白质组学技术研究稳定过表达该基因对SGC-7901细胞蛋白质表达谱的影响.通过对SGC-7901/let-7a细胞的蛋白质表达谱改变的研究,并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析鉴定了10个差异表达蛋白质.这些差异表达蛋白质可能是let-7a功能相关蛋白质,其中抗氧化蛋白2、胰岛素样生长因子结合蛋白2、二硫化蛋白异构酶A2、四氢叶酸合成酶、细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白1、Rho-GTPsae激活蛋白4表达上调,Skp2蛋白、血小板黏附蛋白CD41、纤维连接蛋白、Cks1蛋白表达下调.部分差异表达蛋白质如细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白1、Skp2蛋白和纤维连接蛋白经蛋白质印迹分析进行了验证.在SGC-7901/let-7a中鉴定的10个差异表达蛋白质涉及到细胞周期的调控、分子基因表达调控、细胞黏附、细胞代谢等众多事件,它们可能作为let-7a功能相关蛋白质,为阐明let-7a表达下调在胃癌发病中的机制提供了重要线索.     

不同海拔地区(南京和拉萨)种植的甘蓝型油菜的种子基因差异表达

分别在南京(海拔8.9 m)和拉萨(海拔3 658 m)2个不同海拔地区种植甘蓝型油菜(Brassica napus)高油品系H105, 该材料含油量在两地分别为(46.04±1.42)%和(53.09±1.35)%。利用拟南芥表达谱基因芯片检测两地种植的H105开花后30天种子基因的表达。以种植在南京的H105为对照, 差异表达分析结果显示有421个差异表达的基因, 其中229个基因表达下调, 192个基因表达上调。这些基因按功能可初步分为代谢相关、运输相关、结合相关、转录相关、结构相关、发育相关、信号转导相关、其它相关及功能未知基因等几大类别。一些与光合成、糖代谢以及脂肪酸合成相关的重要基因, 如叶绿素a-b结合蛋白基因家族、蔗糖合酶、丙酮酸激酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂解酶、柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、脂肪酸去饱和酶(FAD6和FAD7)基因等被鉴定为差异表达。研究结果初步揭示了相关基因的表达变化规律, 为探讨油菜在不同海拔地区含油量差异的分子遗传机理提供了重要信息。     

油菜种子的油脂和蛋白积累及相关基因表达的研究

检测了油菜籽成熟过程的总蛋白和粗脂肪含量变化,以及与之相关23个基因在各器官及果荚各发育时期的表达情况。结果显示:蛋白在开花后25天(25 DAF)后大量累积,而油脂则在25 DAF后增速放缓,30DAF后才急剧上升。多数油脂合成相关酶基因在果荚中表达最高,叶片中次之,花蕾和花朵中有少量表达,茎中的表达很低,少数在根中表达,部分基因的表达随油菜果荚发育而持续增加,另一部分则呈先升高,再下降至25 DAF低点,再回升的趋势;转录因子LEC1、LEC2及WRI与贮藏蛋白基因Napin、Cruciferin主要在果荚中表达,前者的表达主要在果荚发育前期大量,其中WRI的出现起伏波动,后者主要在25、30 DAF大量表达。这表明种子成熟时总蛋白和粗脂肪含量变化可能与相关基因表达变化相关。     

甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S花蕾总蛋白质双向电泳体系的建立及应用

以甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S及其近等基因系SP2F为材料,分别采用TCA/丙酮法和Tris-丙酮-酚法提取花蕾总蛋白,并优化电泳体系,对可育和不育花蕾中的蛋白质表达进行差异分析。结果表明:TCA/丙酮法适合于花蕾总蛋白的提取,采用10%浓度的分离胶,上样量为450μg,用pH 4~7的17 cm线性胶条和改良的考马斯亮蓝染色法得到了背景清晰、蛋白点分布均匀且重复性好的电泳凝胶图谱。利用这一实验体系,筛选出SP2S和SP2F之间大量的差异蛋白点。相比SP2F,仅在SP2S中表达的有13个点,上调2倍以上的点有4个,下调2倍以上的点有9个。     

青花菜谷胱甘肽S-转移酶的克隆及表达特性分析

本研究采用RT-PCR技术从青花菜自交系‘WN12-95B’中克隆到谷胱甘肽S-转移酶基因。序列分析表明,青花菜GST基因全长690 bp,ORF长度为675 bp,推导编码蛋白含有224个氨基酸,相对分子量为26.15 kD,理论pI值为6.56,属于Tau类家族成员。青花菜GST蛋白的二级结构主要以α-螺旋和延伸链为主。通过构建系统进化树发现,GST基因与油菜、芜菁亲缘关系最近。利用荧光定量PCR检测GST基因在青花菜保持系不同组织中的表达量,结果显示GST基因在根、叶、荚中的表达丰度较高,花蕾中表达丰度较低。青花菜Ogu不育系及其保持系不同发育阶段花蕾时空表达特性分析表明,花蕾发育早期(2 mm)表达量最高,随着发育进程的推移,表达量逐渐下降。同时期不育系的表达量高于保持系。本研究为探讨青花菜GST基因在花粉发育过程中的功能提供一定理论依据。     

猕猴早期胚胎脑的发育与凋亡相关蛋白P53的表达

目的探讨猕猴早期胚胎脑的发育及细胞凋亡相关蛋白P53的表达.方法建立猕猴早孕模型,获取早期胚胎,采用单克隆抗体链霉素亲生物蛋白过氧化酶 (SP)免疫组织化学方法,检测P53蛋白的表达.结果在猕猴25d、40d和55d胚胎脑均检测到P53免疫反应阳性神经细胞,随着胎龄的增加,P53免疫反应阳性表达率逐渐增大.结论在早期猕猴胚胎脑发育的不同时期内P53蛋白均有表达,并在胚胎脑发育过程中表达逐渐增加,调控脑的发育.     

水稻穗发育功能基因对穗期氮肥的响应

为探讨氮肥对水稻(Oryza sativa)穗发育的调控作用, 使用高通量测序技术检测氮肥处理前后水稻叶片和幼穗组织中转录组的变化, 并从中筛选到大量差异表达基因。这些基因的功能涉及转录调控、激素代谢和信号转导、物质代谢和转运、胁迫响应、信号转导(受体)和蛋白质降解等。同时对目前克隆得到的穗发育相关基因进行分析, 发现在氮素穗肥的作用下, 部分重要功能基因的表达量发生了明显变化, 其中一些基因还参与调控水稻株高、抽穗期、分蘖和结实率等性状。对这些差异表达基因的功能研究有助于揭示氮素穗肥调控水稻每穗颖花数的分子机制。     

油菜种子发育和萌发过程中脱水耐性相关基因的cDNA-AFLP分析

选取甘蓝型油菜种子发育和萌发过程中与脱水耐性相关的不同时间点,采用cDNA-AFLP技术通过128对引物组合分析,共获得394条特异转录衍生片段(TDFs)。经BLAST序列比对,发现其中189条与GenBank数据库中已知功能基因同源,按其功能可分为转录因子、基础代谢、抗逆胁迫、信号转导等相关蛋白。RT-PCR技术对差异显著性片段验证结果显示,泛素蛋白、油体蛋白、热激蛋白和一些转录因子片段均受到种子脱水诱导表达。研究结果表明,发生在种子发育和萌发过程中的脱水耐性反应非常复杂,涉及植物生命活动的诸多领域。     

甘蓝型油菜MADS-box基因家族的鉴定与系统进化分析

MADS-box基因家族参与调控开花时间、花器官分化、根系生长、分生组织分化、子房和配子发育、果实膨大及衰老等植物生长发育的重要过程。基于甘蓝型油菜(Brassica napus)基因组测序数据,利用生物信息学方法对甘蓝型油菜MADS-box基因家族进行鉴定和注释及基因结构与系统进化分析。结果显示,在甘蓝型油菜中鉴定出307个MADS-box基因家族成员,根据进化关系可将其分为两大类型,I型(M-type)包含α、β、γ三个亚家族,II型(MIKC-type)包括MIKCC和MIKC*两个亚家族,MIKCC可进一步分为13个小类;甘蓝型油菜A基因组染色体上分布的MADS-box基因多于C基因组。在基因结构上,MIKC-type亚家族基因序列普遍比M-type长且含有较多的外显子;M-type亚家族蛋白序列中的motif数量为2–5个,MIKC-type亚家族蛋白序列中平均含有7个motif。拟南芥(Arabidopsis thaliana)与甘蓝型油菜MADS-box基因共线性分析结果显示,全基因组复制事件对MADS-box基因家族尤其是MIKC亚家族的扩张起重要作用;MIKC亚家族基因在进化过程中受到的选择压力约为M-type的2倍,这表明MIKC-type亚家族在进化过程中被选择性保留。