小鼠卵巢组织的超速冻存法研究

目的　本实验通过对小鼠卵巢组织进行冻存研究 ,掌握卵巢的低温生物学特性 ,摸索出一种简便有效的组织器官冻存法 ,为卵巢移植及器官冷冻提供有用的技术方法。方法　通过对小鼠卵巢组织进行慢速程序法与快速液氮蒸汽法冻存 ,比较分析了不同方法所需保护剂种类、浓度、渗透平衡时间。采用对解冻后卵巢组织超微结构观察、组织化学染色、激素测定及自体、异体移植后动情期的恢复作为评价指标。结果与结论　通过上述实验表明用同种冷冻保护剂 ,液氮蒸汽法冻存的卵巢组织超微结构保存良好 ;组织化学染色示其活性与程序法冻存组织相同 ;自体、异体移植后 ,小鼠动情周期的恢复率及血清雌二醇水平各项指标均与慢速程序法冷冻无显著性差异     

去势大鼠新鲜、冷冻卵巢移植后激素代谢变化

目的观察去势大鼠经新鲜、冷冻卵巢移植后体内激素代谢变化情况。方法24只去势大鼠经右下腹皮下移植新鲜卵巢（3 d之内乳鼠卵巢）和经过冻存培养后的卵巢（3 d之内乳鼠卵巢）后,检测移植前、移植后1个月2、个月的三碘甲腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）、促甲状腺激素（TSH）、睾酮（T）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、黄体生成素（LH）及卵泡生成素（FSH）。结果冻存卵巢移植前与新鲜卵巢移植前比较：T值升高,有显著性差异（P〈0.01）;冻存卵巢移植后1个月与新鲜卵巢移植后1个月比较差异无显著性（P〉0.05）;冻存卵巢移植后2个月与新鲜卵巢移植后2个月比较：E2升高明显,差异具有显著性（P〈0.01;新鲜卵巢移植后2个月与移植前比较：T4,T,E2,P,LH均有明显升高（P〈0.01;P〈0.05）;冻存卵巢移植后2个月与移植前比较：E2,P增高明显（P〈0.01;P〈0.05）。结论冷冻卵巢移植较新鲜卵巢移植功能恢复明显。     

哺乳动物卵母细胞异位发育技术及其研究进展

综述了哺乳动物卵巢移植在生物医学上的应用,及借助卵巢异位发育研究卵巢卵母细胞发育机制的研究进展;详细介绍了卵巢移植的不同技术方法,及移植后卵巢卵母细胞的发育、激素的调节机制,分析了卵巢移植早期卵泡生长和凋亡的分子机理及其在移植医学中的应用前景,并就新鲜和冻融卵巢如何用于动物辅助生殖进行了阐述.特别关注卵巢卵母细胞异种移植的潜在价值,卵巢异种移植不仅可以保存稀有和濒危物种,还可以为当前辅助生殖技术提供一个理想的实验手段.     

新生小鼠卵巢组织的玻璃化冻存、移植及分离卵泡的体外成熟培养初步研究

目的:系统地探索新生小鼠卵巢组织的玻璃化冻存建立卵巢库,移植和分离卵泡以及体外成熟培养的实验方法。方法:对1日龄小鼠卵巢组织进行冻存,解冻复苏和同种肾包膜下移植,从卵巢移植物种中进行卵泡分离和体外成熟培养。结果:①采用平衡液(ES)处理25min,玻璃化液(VS)处理3min方案冻存的卵巢组织具有更高比例的形态完整卵泡,其完整原始卵泡率均值达96.6%,显著性高于实验中其它四组方案(P0.05);②在分别移植2周和4周后回收卵巢移植物,发现二者的卵巢回收率无显著差异(P0.05),但移植4周组的卵泡回收数目要明显高于2周组(P0.05);③在培养基中添加适量的自体血清(10%,V/V)能显著提高卵子的体外成熟率,培养12h后对照组中生发泡破裂(GVBD)发生率为(34.74±4.26)%,添加血清后提高至(54.60±3.37)%,成熟的MⅡ期卵子获得率从(43.17±1.31)%升高至(57.75±5.31)%,有显著性差异(P0.05)。结论:通过该实验较好地建立了卵巢组织的玻璃化冻存、移植和卵泡分离以及体外成熟培养的实验方法。     

与衰老相关的母源性生育力下降

老龄妇女与雌性动物生育力下降和丧失的原因包括卵母细胞库减少以及卵巢、输卵管和子宫的结构和功能障碍,但由减数分裂错误引起的卵母细胞质量下降是与衰老相关的母源性生育力下降的主要原因之一。卵母细胞的减数分裂错误主要表现为非整倍性和染色单体提前分离。本文主要综述了影响母源性生育力的各种因素、老龄动物卵母细胞减数分裂错误的原因、纺锤体和染色体改变的机制以及小鼠作为研究妇女年龄与生育力相互关系的动物模型等问题。     

雄性受体小鼠性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响

目的探索雄性受体性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响。方法将1日龄小鼠卵巢移植入成年雄鼠肾囊下,将雄性受体小鼠分为性腺摘除组和性腺在位组,于21d回收移植卵巢,以评价雄性小鼠性腺对新生小鼠卵巢移植体卵母细胞生长发育的影响。结果移植后21d,性腺摘除组和性腺在位组卵巢回收率分别为80.0%和92.9%,移植体生长增大;每个卵巢平均回收卵母细胞数分别为(30.4±4.3)和(42.4±11.1)个,两者差异不显著(P0.05);性腺摘除组回收的均为GV期卵母细胞,性腺在位组大部分为GV期卵母细胞,有的达到MII期。结论雄性受体小鼠能够支持移植卵巢卵母细胞的生长发育,雄性受体的性腺对其影响不明显。     

小鼠卵巢冷冻移植后卵泡发育和卵母细胞成熟的研究

本研究探讨了冷冻保存的1日龄小鼠卵巢异体异位移植后,其原始卵泡重新启动生长发育的能力。一日龄B6C2F．小鼠卵巢分离冷冻后置液氮中保存,保存1周。6个月后解冻,并将卵巢移植到8-12周龄B6C2F．受体鼠。肾脏包膜下,移植至少14d。每侧肾囊移植2枚卵巢的40只受体鼠中卵巢的回收率为45．00％（72／160）,而每侧。肾囊移植l枚卵巢的20只受体鼠的回收率为82．50％（33／40）。移植卵巢上卵泡的发育基本与体外自然生长鼠的卵巢卵泡发育情况一致。对卵巢移植19d的受体鼠用孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG）处理后,从移植卵巢上发育成熟卵泡中获得的卵母细胞在MEM0c培养基中培养16-17h,有40．90％的卵母细胞发生生发泡破裂（germinal vesicle breakdown,GVBD）,其中89．02％的卵母细胞发育到第二次减数分裂中期（metaphaseⅡ,MⅡ）。将剩余的卵母细胞继续培养到20～21h,又有50．83％的卵母细胞发生生发泡破裂,但其中只有21．40％的卵母细胞能够发育到MII期。以上结果说明,小鼠早期卵巢经过冷冻．解冻并异体异位移植后,其原始卵泡能够重新启动生长发育,发育后的卵泡卵母细胞能够在体外培养成熟。这些结果意味着原始卵泡或卵巢冷冻一移植技术有可能充分利用雌性生殖细胞用于濒危动物保种、建立动物基因库和人类辅助生殖等。     

VEGF在人胎卵巢发育过程中的表达研究

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）在人胚胎卵巢组织发生过程中的表达特征,探讨其在卵巢发生中的作用。方法采用HE染色和SP免疫组织化法学法检测VEGF在不同胎龄卵巢组织中的表达变化。结果VEGF在胎儿卵巢初级卵母细胞、卵泡细胞、部分基质细胞呈阳性表达,在卵母细胞的染色程度均强于卵泡细胞和基质细胞,基质小血管内皮也有阳性表达。其在卵母细胞中以胎24w阳性细胞多且表达量强,此后呈逐渐下降趋势。结论胎儿卵巢存在局部调节因子,VEGF表达于人胎卵巢中,以自分泌或旁分泌方式参与卵母细胞生长,在卵巢发生、发育过程中起着一定的作用。     

小鼠睾丸组织慢速冷冻保存工艺的优化研究

目的 冷冻保存睾丸组织用于后期移植,是除精子冻存以外保持男性生育力的另一有效途径。本文对块状睾丸组织常用的慢速冷冻降温程序进行了改进。方法 通过缩短保护剂加载时间、提高第一阶段的冷却速率、第二阶段直接投入液氮等方法对小鼠睾丸组织进行冷冻保存。在不同温度对小鼠睾丸组织冻存体系进行诱导冰晶成核并冻存,降低睾丸组织慢速冷冻保存所需保护剂浓度。结果 改进的两步法冻后组织内生殖细胞的凋亡阴性率均较高,其中精原细胞98.4%、精母细胞99.2%、精子细胞88.4%、支持细胞98.1%,显著高于常用慢速冷冻组,与对照组均无显著性差异。相比于未置核组, -10℃置核可显著提高5% DMSO保护剂慢速冷冻保存的冻后效果,生殖细胞的凋亡阴性率为精原细胞82.9%、精子细胞92.1%、精母细胞93.2%及支持细胞88.9%,与较高浓度保护剂10% DMSO组冻存结果无显著性差异,说明置核能够降低所需保护剂的浓度,降低毒性损伤。结论 本研究通过改进两步法和置核提高了小鼠睾丸组织冻后的质量,为临床上人睾丸组织的冻存提供参考。     

斑马鱼精子冻存与复苏实验方法与流程

斑马鱼是研究胚胎发育及其遗传机制的重要模式脊椎动物。目前人们已经积累了大量的突变体和转基因鱼系, 如何安全、妥善地长期保存这些品系是每一个研究斑马鱼的实验室都会面临的问题。精子冻存与复苏技术是目前最为简单有效的一种长期保存斑马鱼遗传品系的方法。应用这一技术不仅可以节省大量的鱼房空间与人力、物力, 使鱼系的使用与保存更加灵活和持久, 更重要的是能够防止珍贵鱼系的意外丢失, 为鱼系保种提供额外的保障。这类方法一般是通过体外挤出精子或研磨精巢获取新鲜的精子, 用适量的冻存液混匀后, 分装保存在液氮罐中。需要时可以随时通过体外授精的方法使精子复苏。经过30年的发展, 随着冷冻保护剂的不断改良和冻存与复苏条件的不断优化, 斑马鱼精子冻存与复苏技术已逐渐成熟。文章简单回顾了斑马鱼精子冻存与复苏技术的历史与发展, 并重点介绍本实验室自2005年以来常规使用的斑马鱼精子冻存与复苏的方法及具体流程。
补充资料 ：冻存与复苏实验指南 [视频]     

PNAS：恢复生殖细胞或可改善女性生殖力

一种使女性的正常休眠的生殖细胞进入活跃状态的方法可能让科学家帮助衰老的女性。或者在接受癌症治疗之前冷冻了卵巢的女性生育子女。     

新生小鼠卵巢移植雄鼠肾囊下卵泡的生长发育

将1日龄小鼠卵巢移植入成年雄鼠肾囊下,分别于移植后18d、36d回收移植卵巢进行形态学、组织学观察,以评价卵巢移植体在成年雄性受体小鼠体内生长及卵泡发育潜能。结果表明:移植体生长增大,有各级生长卵泡发育;18日龄移植体平均直径为1881.1μm±204.7μm,与1日龄卵巢相比差异极显著(P<0.01),卵泡发育到有腔卵泡阶段;36日龄移植体平均直径达2575.3μm±466.4μm,显著大于18日龄移植体(P<0.01),有成熟卵泡出现,未观察到黄体;从移植体分离到GV期卵母细胞和卵丘卵母细胞复合体。研究表明1日龄小鼠卵巢移植体在雄性受体生理环境中具有正常生长发育和形成成熟卵泡的潜能。     

5-HT和GnRH及其受体在长牡蛎卵巢的生理作用机制——双染和免疫细胞化学定位

用免疫细胞化学与双染技术对5-HT和GnRH及其受体在长牡蛎卵巢中的分布的研究结果提示,不同发育时期卵巢中卵母细胞均存在5-HT和GnRH受体,受体阳性物质沿胞膜分布,显深棕色,核显免疫阴性反应;5-HT和GnRH及其共存于不同时期卵母细胞胞质和胞膜上。以上结果表明长牡蛎的卵母细胞不仅能产生5-HT和GnRH,而且能表达5-HT和GnRH的受体,5-HT和GnRH可能以自分泌的方式对卵母细胞起调节作用。     

冻融小鼠卵巢移植后细胞凋亡及血管内皮生长因子表达的变化及意义研究

目的:探讨冻融小鼠卵巢同种异体移植后细胞凋亡及血管内皮生长因子表达的变化及意义。方法:收集C57BL/6j雌鼠和BALB/c雄鼠杂交后F1代4周龄小鼠卵巢,慢冻速融后移植至杂交后F1代8～12周雄鼠的肾被膜下,分别于移植后1d(24h)、2d(48h)和7d回收移植物,将冻融以及移植后不同时间段的卵巢组织进行HE染色、全卵巢卵泡计数、电镜观察、免疫组织化学分析细胞凋亡及RT-PCR检测VEGF基因表达。结果:冻融小鼠卵巢移植后随着时间的推移、各级卵泡数和卵泡存活率逐渐下降;移植后48h内细胞凋亡指数最高;电镜观察发现小鼠卵巢组织移植后损伤主要发生在移植后48h内;移植后VEGF的表达有上升的趋势,至第7d仍维持较高水平;移植后48hVEGF120mRNA和VEGF188mRNA水平明显升高(P0.05),至7d下降恢复至移植前水平,而VEGF164mRNA水平移植后无明显变化(P0.05)。结论:小鼠卵巢组织移植后48h内细胞凋亡最为严重,移植后引起大量卵泡的丢失;在移植后血管化的过程中VEGFmRNA表达量增加,VEGF120mRNA和VEGF188mRNA可能参与卵巢移植后早期血管化过程。     

原始卵泡库的形成、维持和激活分子调控机制研究进展及其临床应用

卵泡是哺乳动物卵巢结构和功能的基本单位,由位于中央的卵子和周围的体细胞组成。原始卵泡是卵泡发育的最早阶段,在哺乳动物出生前后形成。由于数量有限,原始卵泡构成了卵巢的储备库,为女性的生殖周期提供成熟卵子。原始卵泡在大部分时间内处于休眠状态,直到被激活后开始生长和发育,最终成为可排卵的成熟卵泡。原始卵泡休眠与激活的动态平衡对于卵巢生殖功能的维持非常重要,而各种因素导致的原始卵泡库提前耗竭则可能引起女性的早发性卵巢功能不全。该文系统总结了过去二十年关于原始卵泡形成和激活分子机制的研究进展,全面概述了原始卵泡体外激活技术的发展和在治疗早发性卵巢功能不全或卵巢功能障碍导致的不孕症患者中的临床应用。此外,该文就如何调节原始卵泡库来保护卵巢储备、延缓卵巢衰老方面的研究也进行了讨论,为诊断和治疗与卵泡发育相关的疾病、卵巢性不孕不育的干预以及女性生育力保存提供了新的思路。     

成体雌性小熊猫卵巢组织学观察

2000 年至2009 年,12 只固定于10% 福尔马林中非生殖系统疾病死亡的小熊猫卵巢组织,按常规组织学技术制作组织切片,HE 染色,光学显微镜观察。结果:(1)不同发情时期卵巢均有原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡分布。发情期的卵巢未观察到典型的成熟卵泡和卵母细胞; (2)原始卵泡数量较少,初级卵泡数量较多,多数初级卵泡和大多数的次级卵泡都处在闭锁状态;(3)卵泡腔出现之前,卵母细胞的直径和卵泡直径同时增长;卵泡腔出现之后,卵母细胞直径增长较慢,卵泡直径增长较快; (4)不同发情时期的小熊猫卵巢均存在大量的间质腺细胞;(5)妊娠小熊猫和发情间期无妊娠小熊猫的卵巢均有发育正常的黄体;(6)卵泡细胞发育呈低柱状至柱状时出现透明带。结论:(1) 卵泡闭锁主要发生在初级卵泡阶段,仅少数卵泡能发育至次级卵泡;(2)卵母细胞和卵泡生长呈双相生长的趋势; (3) 不同发情时期的小熊猫卵巢间质腺都发达; (4)发情排卵后,非妊娠黄体与妊娠黄体维持的时间相似,证实了小熊猫存在假孕现象。     

人外周血淋巴细胞长期冻存后结构和功能的研究

从肝素和 ACD 抗凝血中分离的淋巴细胞,用 DMSO 或甘油作为低温保护剂,保存在液氮内,在冻前和冻后10、20、40和365天时分别检测细胞的功能活性。当冻存液内含10%DMSO 和40%人 AB 血清时,冻存效果最好。冻存一年时,淋巴细胞的回收率和存活率均大于92.5%。冻存细胞的 E 和 ME 花环形成率、ANAE 阳性率、LDH 同工酶谱和细胞超微结构与冻前相比,均无明显变化,冻存细胞的淋转能力虽在冻存初期有所下降,以后就处于稳定状态。     

美洲鲥雄性生殖细胞冷冻保存及移植

采用分离细胞冻存和组织块直接冻存2种方法, 进行美洲鲥(American shad, Alosa sapidissima)精巢细胞的长时间冷冻保存(>250d), 并比较分析2种不同冻存方法对美洲鲥雄性生殖细胞的冻存效果。解冻复苏后用Hochest33342和PI共染细胞核, 分析统计各期雄性生殖细胞的存活率, 结果显示组织块冻存方法所得精原干细胞和精母细胞的存活率明显高于分离细胞冻存的; 而精细胞及其他细胞存活率在2种方法间无显著差异; 特别是, 镜检发现组织块冻存方法所得精子存活率高达93.83%, 说明此冻存方法能同时高效地冻存美洲鲥各期生殖细胞, 包括成熟的精子。同时, 将组织块冻存的美洲鲥生殖细胞用PKH26染色标记后移植到出苗第1天的斑马鱼仔鱼中, 在细胞植入后5d仍能在受体中检测到供体细胞, 且有部分供体细胞能与内源生殖细胞共定位, 表明经过长时间冷冻保存的美洲鲥生殖细胞仍具有生殖细胞特性, 且能整合到斑马鱼受体性腺原基。研究结果为进一步开展美洲鲥, 或其他洄游性鱼类的生殖细胞发育、培养及种质资源保存等研究工作奠定了技术理论基础。     

哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存研究进展:现存问题与未来展望

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据,并成为体外受精不可缺少的环节.尽管哺乳动物卵母细胞和胚胎的冷冻保存技术的研发和应用取得了巨大进展,例如为可能不育的患者贮藏生殖潜能、卵子冻存库的建立以及卵母细胞和胚胎的跨国运输,但成功率仍达不到使用新鲜卵母细胞和胚胎的水平,还存在许多难题有待解决.本文针对低温保存技术中制约冷冻效率和成功率的主要问题进行了综述,旨在解决技术研发中遇到的瓶颈,为改进技术提供借鉴和参考,鼓励低温生物学研究者继续开展深入研究,加快推进冷冻保存技术在人类和动物辅助生殖技术中的实际应用.     

哺乳动物卵母细胞的DNA损伤与修复研究进展

DNA损伤是影响配子发生和胚胎发育的关键因素之一。卵母细胞容易被各种内外源因素(如活性氧、辐射、化疗药物等)诱发DNA损伤。目前研究发现,对于各类DNA损伤,各发育阶段的卵母细胞能够做出相应的DNA损伤反应,通过复杂的机制对DNA进行修复或者启动细胞凋亡。相比于进入生长阶段的卵母细胞,原始卵泡卵母细胞更容易被DNA损伤诱导凋亡。DNA损伤不易诱导卵母细胞减数分裂成熟进程停滞,然而携带DNA损伤的卵母细胞的发育能力明显下降。在临床上,衰老、放疗和化疗是导致女性卵母细胞DNA损伤、卵巢储备降低和不孕的常见原因。为此,人们尝试了能够减轻卵母细胞DNA损伤和增强DNA修复能力的多种方法,试图保护卵母细胞。本文对哺乳动物的各发育阶段卵母细胞的DNA损伤与修复的相关研究进行了梳理和总结,并讨论了其潜在的临床价值,以期为生育力保护提供新的策略。