酿酒酵母TRK1和TRK2钾吸收缺陷型菌株的构建

为更好的进行钾素营养有关基因表达调控和功能性研究,我们采用同源重组法通过重叠引物扩增分别将URA3和HIS3基因替代酿酒酵母的TRK1和TRK2基因,并以酿酒酵母的尿嘧啶合成酶URA3基因和组氨酸合成酶HIS3力标记基因,在不舍尿嘧啶和组氨酸的基本培养基筛选转化子获得了钾离子转运蛋白TRK1和TRK2基因缺失的酿酒酵母钾素营养缺陷型菌株,该菌株在低K 培养基中导入拟南芥K 转运体基因AtKuP1可恢复正常生长.     

酿酒酵母Mbp1缺陷型菌株的构建及其乙醇发酵特性

【目的】研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株Mbp1基因的功能,探讨Mbp1基因对酿酒酵母乙醇发酵性能的影响。【方法】以酿酒酵母MF1015为出发菌株,用PCR方法构建Mbp1基因敲除组件Loxp-KanMX-Loxp,将敲除组件转化两种配型的酿酒酵母单倍体,通过单倍体复倍获得敲除Mbp1基因的二倍体突变菌株,研究突变菌株形态变化及乙醇发酵特性。【结果】敲除Mbp1基因后突变菌株生长曲线无显著变化,出芽率降低,细胞体积增大19.2%,对饥饿更敏感,较早出现假菌丝。甘蔗糖蜜在静置条件下发酵,突变菌株的乙醇产量明显低于野生型;在130 r/min的条件下发酵,突变菌株和野生型发酵液中的乙醇产量基本相同。【结论】Mbp1基因缺失使酿酒酵母的乙醇发酵能力下降并影响细胞的形态分化。     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌：DH5α,用5′端与组氨酸基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大肠杆菌及其他菌株中快速、精确的构建营养缺陷型菌株提供了有益的参考。     

脊髓灰质炎病毒缺陷型载体瞬时表达系统I的构建

为探索可表达较大片段外源基因的脊灰病毒重组载体,以ＨＢＶ－Ｓ基因置换脊灰病毒的Ｐ１基因,同时以另一途径提供脊灰病毒Ｐ１结构蛋白,经转染入Ｈｅｌａ细胞中形成缺陷型重组病毒颗粒,此病毒可以感染新的细胞,并表达其重组的外源基因,但不产生子代病毒。实验结果表明,这种瞬时表达系统的构建,为脊灰病毒缺陷型重组载体用于基因转导技术打下基础。     

电转化法构建变形链球菌UA159 comD缺陷菌株

目的构建变形链球菌UAl59密度感应相关的comD基因缺陷菌株,为进一步研究该基因功能做准备。方法根据同源重组原理,利用变形链球菌UAl59comD基因同源重组DNA片段,采用电击转化方法获取转化菌落,通过形态学观察、生化特性检测、PCR及测序、RT-PCR对缺陷菌进行鉴定。结果在含有红霉素（10μg/mL）的琼脂平板上出现转化菌落,鉴定结果均显示转化菌为comD缺陷菌。结论成功构建了变形链球菌UA159comD基因缺陷菌株。     

脊髓灰质炎病毒缺陷型载体瞬时表达系统Ⅰ的构建

为探索可表达较大片段外源基因的脊灰病毒重组载体,以HBV-S基因置换脊灰病毒的P1基因,同时以另一途径提供脊灰病毒P1结构蛋白,经转染入Hela细胞中形成缺陷型重组病毒颗粒,此病毒可以感染新的细胞,并表达其重组的外源基因,但不产生子代病毒.实验结果表明,这种瞬时表达系统的构建,为脊灰病毒缺陷型重组载体用于基因转导技术打下基础.     

脊髓灰质炎病毒缺陷型载体瞬时表达系统Ⅰ的构建

为探索可表达较大片段外源基因的脊灰病毒重组载体,以ＨＢＶＳ基因置换脊灰病毒的Ｐ１基因,同时以另一途径提供脊灰病毒Ｐ１结构蛋白,经转染入Ｈｅｌａ细胞中形成缺陷型重组病毒颗粒,此病毒可以感染新的细胞,并表达其重组的外源基因,但不产生子代病毒。实验结果表明,这种瞬时表达系统的构建,为脊灰病毒缺陷型重组载体用于基因转导技术打下基础。     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法*

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌DH5α,用 5′端与组氨酸基因同源 ,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物 ,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下 ,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组 ,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因 ,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点 ,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除 ,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大     

稳定遗传的染色体组合整合酿酒酵母重组菌株的构建

染色体整合表达可获得稳定遗传的基因工程菌,是工业酿酒酵母育种的重要手段。pAUR135整合载体是抗生素标记基因可循环使用的载体,添加特定的同源臂后可构建在酵母染色体上稳定遗传的菌株。目前对酵母菌的分子育种常需要对多个基因进行过表达,利用pAUR135载体可将不同基因分别整合在不同染色体或相同染色体的不同位点,这种组合整合表达方法可对不同基因的表达强度比例进行调节,构建表型优化的工业酿酒酵母菌株。本研究以木糖代谢途径基因为例,构建了3个pAUR135整合载体,将3个木糖代谢基因依次整合到工业酿酒酵母染色体的不同位点,获得了染色体组合整合表达的代谢工程菌株。与将这3个基因整合在同一个位点的对照重组菌株相比,染色体组合整合的重组菌株木糖利用率提高了24.4%–35.5%。多基因染色体组合整合方法从新的角度对工业酵母进行代谢工程改造,所获得的工程菌株不带有任何外来基因和选择标记,可以保持性状的稳定,是工业酿酒酵母分子育种的新方法。     

金黄色葡萄球菌OatA基因敲除菌株及其回补菌株的构建

目的:构建金黄色葡萄球菌(金葡菌)Oat A基因敲除菌株及其回补菌株。方法:以p BT2为载体,构建金葡菌Oat A基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经金葡菌RN4220修饰后电转入金葡菌USA300,利用p BT2载体对温度敏感的特点,在42℃多次传代,筛选出金葡菌Oat A基因敲除菌株。以p LI50为载体,构建p LI50-Oat A全基因回补质粒,电转入金葡菌RN4220,再次抽提后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因回补菌株p Oat A。结果:成功构建基因敲除质粒p BT2-△Oat A,经RN4220修饰电转入USA300,经PCR及测序鉴定,获得了金葡菌Oat A敲除菌株△Oat A。经PCR及酶切鉴定,确认p LI50-Oat A回补质粒构建成功,通过金葡菌RN4220修饰后电转入敲除菌株△Oat A,获得基因敲除回补菌株p Oat A。结论:成功构建金黄色葡萄球菌Oat A基因敲除菌株及其回补菌株,为进一步研究金葡菌Oat A的功能及其作用机制奠定基础。     

Homologous recombination and transposition generate chromosome I neopolymorphism during meiosis in Saccharomyces cerevisiae

We have studied the meiotic segregation of a chromosome length polymorphism (CLP) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The neopolymorphism frequently observed within the smallest chromosomes (I, VI, III and IX) is not completely understood. We focused on the analysis of the structure of chromosome I in 88 segregants from a cross between YNN295 and FL100trp. Strain FL100trp is known to carry a reciprocal translocation between the left arm of chromosome III and the right arm of chromosome I. PCR and Southern hybridization analyses were performed and a method for the rapid detection of chromosome I rearrangements was developed. Seven chromosome I types were identified among the 88 segregants. We detected 22 recombination events between homologous chromosomes I and seven ectopic recombination events between FL100trp chromosome III and YNN295 chromosome I. These recombination events occurred in 20 of the 22 tetrads studied (91%). Nine tetrads (41%) showed two recombination events. This showed that homologous recombination involving polymorphic homologues or heterologous chromosomes is the main source of neopolymorphism. Only one of the seven chromosome I variants resulted from a transposition event rather than a recombination event. We demonstrated that a Ty1 element had transposed within the translocated region of chromosome I, generating mutations in the 3′ LTR, at the border between U5 and PBS. Received: 7 May 1999 / Accepted: 14 February 2000     

Purification and Characterization of an Endo-Polygalacturonase from a Mutant of Saccharomyces cerevisiae

An extracellular endo-polygalacturonase (PGase) produced by a mutant of Saccharomyces cerevisiae was isolated. The enzyme was regarded, immunologically, as a PGase belonging to the Kluyveromyces marxianus group. The enzyme had properties similar to the PGase from K. marxianus in heat and pH stability, and N-terminal amino acid sequence. However, the enzyme showed different properties in optimum pH and temperature, molecular weight, and reactivity in antiserum against PGase from K. marxianus, indicating that the enzyme has a different molecular structure from the PGase from K. marxianus.     

产金属硫蛋白酿酒酵母诱变菌株的生物学功能研究

以酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)单倍体菌株SY1为出发菌株 ,通过紫外线和亚硝基胍复合诱变 ,获得 1株Cu2 高抗性突变株 ,并对其生物学功能进行了研究。结果表明 ,其拮抗紫外线 ,拮抗电离辐射 ,清除·OH自由基能力 ,Cu2 解毒能力均比出发菌株有所提高 ,经 5 0世代培养后 ,其遗传稳定性保持在 96 %以上。     

同源重组法构建枯草芽孢杆菌224 yugS基因缺失突变株

从枯草芽孢杆菌224的基因组DNA中分别扩增出溶血样基因yugS的上、下游片段,并利用携带新霉素抗性基因(neor)的重组质粒pMD18-T-neo作为骨架,构建了基于yugS基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yugS,线性化后电转化入枯草杆菌224,从新霉素抗性平板上挑取转化子,通过对基因组的PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定转化子yugS156为yugS基因缺失突变株。     

一个酿酒酵母呼吸突变株在高糖胁迫下的生理特性研究

MF11a为甘蔗糖蜜乙醇发酵野生型高产菌株MF1002的呼吸突变体,对糖分的利用能力显著高于MF1002。本文研究了这两菌株应激高糖胁迫的生理特性变化。结果表明,高糖培养条件下,MF11a菌株的生长和乙醇发酵受抑制的程度均明显低于MF1002,培养基的葡萄糖浓度为30%和40%时,其最大菌体密度、最高出芽率和乙醇浓度等已显著高于MF1002,表明MF11a较MF1002具有更强的高糖耐受能力。在30%葡萄糖的胁迫培养条件下,两菌株胞内的总超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶活力、过氧化物酶活力,及它们细胞质和线粒体的ATP酶活力均显著上升,说明这五种酶均参与了两菌株的高糖胁迫反应。其中,MF11a的胞内过氧化氢酶活性、过氧化物酶活力、细胞质ATP酶活力在高糖胁迫下的上升幅度显著高于MF1002,表明这三种酶活力可能与MF11a菌株的高糖耐受能力有关,可作为该菌株进一步改造的指导指标。     

Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae

DNA repair functions are essential for the maintenance of genetic integrity and are regulated in response to both environmental and chemical stressors in mammalian and yeast cells in culture. The inhibitory effect of limited O₂ availability on DNA repair functions in general and on homologous recombination (HR) in particular, correlates with increased chromosomal abnormalities in hypoxic cancer cells. Given the above, we have investigated the effects of CoCl₂,––a hypoxia mimetic agent on HR and genetic aberrations in Saccharomyces cerevisiae. Our studies demonstrate that both acute and chronic exposure to CoCl₂ activated HR and increased genetic aberrations in S. cerevisiae D7 cells. At early time points following addition of CoCl₂ to the growth media, cells were briefly arrested in the G1-S boundary concomitant with a transient increase in Rad52-GFP foci formation and induction of low levels of DNA damage. The mode of action of CoCl₂ is thus similar to that of DNA synthesis inhibitors, the later are known to induce HR and cause G1-S arrest. We propose that the activation of HR in the presence of the hypoxia mimetic agent may be attributed to the replication stress and/or DNA damage induced by the stressor.     

酿酒酵母中对抗真菌药物克霉唑敏感的突变菌株的筛选

克霉唑是一种临床上用于抗真菌感染的抗真菌药物,同时也具有治疗其他疾病如疟疾、脚气病、足癣和癌症的前景。通过96孔板液体培养及倍比稀释的方法,对模式真菌酿酒酵母双倍体单基因缺失株文库中的4 532个非必需基因缺失株进行初步筛选及表型验证,对筛选出的敏感菌株测定了加克霉唑和不加克霉唑细胞内的ROS水平变化。筛选得到了127个克霉唑敏感的单基因缺失株,127个敏感菌株缺失的基因,其功能分别参与细胞的代谢过程、细胞周期和DNA加工过程、转录过程、蛋白命运(折叠,修饰,靶向运输)、细胞运输、细胞通讯/信号转导机制、细胞命运、细胞组分的发生和起源、不同细胞类型的分化、细胞营救、防御及毒力、细胞与环境交流和调节代谢及蛋白功能的过程,也有33个基因的功能未知。ROS测定结果显示,加入克霉唑之后,和野生型相比,25个菌株细胞内ROS显著升高,13个菌株细胞内ROS水平反而显著降低。克霉唑的抗真菌作用可能是多个细胞过程的集合,研究结果为克霉唑的改进利用及新的抗真菌药物研发提供理论基础。     

植物基因同源重组研究现状

同源重组是普遍存在的生物学现象,从噬菌体、细菌到相传真核生物均有存在。它对生物的遗传与变异具有重大影响,一直是生物学家研究的热点。本文从染色体外同源重组、染色体内同源重组以及基因打靶三个方面综述了同源重组在植物方面的研究现状。从分子水平上较详尽的介绍了同源重组发生的机制以及同源重组在生物领域的应用、前景展望及其存在的局限性。     

酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建

酿酒酵母乙醇合成代谢过程中, 阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流, 同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Dadh2为出发菌株, 应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件, 转化酿酒酵母YS2-Dadh2敲除ald6基因, 之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中, 半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记, 最后, 传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因, 最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Dald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比, 突变株乙酸合成量降低18%, 乙醇最高产量提高12.5%。