小凹蛋白-1下调人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流

为了探讨小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)细胞外钙敏感受体(extracellular Ca2+-sensing receptor,CaR)介导Ca2+内流中的作用,本实验研究了细胞膜穴样凹陷(caveolae)结构破坏剂Filipin或Cav-1基因沉默后对CaR介导Ca2+内流的影响。Fura-2/AM负载检测细胞内Ca2+浓度(intracellular Ca2+ concentration,[Ca2+]i)。结果显示,HUVECs中CaR对不同浓度细胞外Ca2+刺激无反应。无论细胞外为零钙液或含钙液时,精胺(Spermine,2mmol/L)刺激CaR时均引起[Ca2+]i升高(P<0.05),其中细胞外液为含钙液时,[Ca2+]i升高较细胞外为零钙液时更明显(P<0.05),CaR的负性变构调节剂Calhex231(1μmol/L)均可完全阻断Spermine刺激引起的[Ca2+]i升高(P<0.05);相反,Spermine升高[Ca2+]i作用可被Filipin(1.5μ...     

CX3CL1介导人脐静脉内皮细胞骨架改变的功能研究

该研究探讨了趋化因子CX3CL1对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)骨架的影响及其作用机制。CX3CL1刺激HUVECs后,采用免疫荧光染色技术检测细胞骨架蛋白纤维状肌动蛋白(F-actin)的分布和形态改变,采用Western blot技术检测胞质内F-actin和磷酸化促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)的三种亚型[p38、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)]的表达水平。结果显示,10 nmol/L CX3CL1刺激HUVECs 30 min后,细胞的致密外周带逐渐被破坏,胞质内有应力纤维形成;120 min后,外周带消失,胞质内有大量的致密应力纤维形成;180 min后,胞质内应力纤维减少,少数细胞可见致密外周带。10 nmol/L CX3CL1刺激HUVECs30 min后,F-actin的表达水平逐渐升高,并于120 min后达峰值;10 nmol/L CX3CL1刺激HUVECs 1 min后,磷酸化p38、ERK1/2和JNK表达水平升高,5 min后三者的表达水平达峰值;5μg/m L抗CX3CR1抗体抑制10 nmol/L CX3CL1刺激HUVECs后,磷酸化p38、ERK1/2和JNK的表达水平降低;30μmol/L p38的特异性抑制剂SB203580和ERK1/2的特异性抑制剂PD98059抑制10 nmol/L CX3CL1刺激HUVECs后,胞质内应力纤维减少,应力纤维变短,F-actin的表达水平降低。以上研究结果表明,CX3CL1能通过p38和ERK1/2信号通路以时间依赖方式介导HUVECs细胞骨架的重构。     

Martentoxin对TNF-α引起脐静脉内皮细胞释放一氧化氮的影响

目的：研究东亚钳蝎毒素Martentoxin对脐静脉内皮细胞释放NO的影响。方法：人脐带经胶原酶消化分离后获得脐静脉内皮细胞,经抗血管性血友病8因子鉴定后,用TNF-α建立NO释放模型,观察Martentoxin对脐静脉内皮细胞释放NO的影响。结果：①经6,12,24h作用后,10μM、100μM Martentoxin能降低TNF-α引起的NO释放增加（P〈0．05）。②Martentoxin降低TNF-α引起的iNOS活性增强并对TNF—α引起的内皮源性一氧化氮合酶mRNA下调具有一定保护作用（P〈0．05）。结论：Martentoxin抑制TNF-α引起的脐静脉内皮细胞释放NO增加。     

Martentoxin 对TNF-α 引起脐静脉内皮细胞释放一氧化氮的影响

目的:研究东亚钳蝎毒素Martentoxin对脐静脉内皮细胞释放NO的影响。方法:人脐带经胶原酶消化分离后获得脐静脉内皮细胞,经抗血管性血友病8因子鉴定后,用TNF-α建立NO释放模型,观察Martentoxin对脐静脉内皮细胞释放NO的影响。结果:①经6,12,24h作用后,10μM、100μM Martentoxin能降低TNF-α引起的NO释放增加(P<0.05)。②Martentoxin降低TNF-α引起的iNOS活性增强并对TNF-α引起的内皮源性一氧化氮合酶mRNA下调具有一定保护作用(P<0.05)。结论:Martentoxin抑制TNF-α引起的脐静脉内皮细胞释放NO增加。     

STIM和Orai在钙库操纵的钙内流途径及心脑血管疾病中的作用

钙库操纵的钙内流(SOCE)是调节钙离子(Ca2+)内流进入细胞最普遍的一种途径,它的通道称为钙库操纵的钙内流通道(SOC)。SOC存在于大多数非兴奋细胞和部分兴奋细胞上,近年来确定,STIM和Orai是组成SOC的两种主要蛋白质。本文就近年来对SOCE途径的机制,STIM和Orai不同亚型的结构、功能及在心脑血管疾病中的作用作一综述。     

胞内钙与蛋白激酶C对人脐静脉内皮细胞组织因子途径抑制物及组织…

为探讨细胞内钙及蛋白酶Ｃ在血管内皮细胞释放细胞因子,组织因子途径抑制物中的作用,本文采用钙离子载入剂Ａ２３１８７与蛋白激酶Ｃ激动剂佛波脂刺激原代培养人脐静脉内皮细胞,观察各实验组内皮细胞冻融液中ＴＦ活性及条件培养液中ＴＦＰＩ活性的变化,以一期凝固法则ＴＦ活性,二期生色法测定ＴＦＰＩ活性。     

三氧化二砷对人脐静脉内皮细胞凋亡及VCAM-1/ICAM-1 表达的影响

目的:观察三氧化二砷(As2O3)对血管内皮细胞增殖、凋亡及VCAM-1/ICAM-1表达的影响,探讨As2O3对血管内皮细胞增殖生长以及炎症反应的影响。方法:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养,以不同As2O3浓度及时间对其进行干预。采用CCK-8测定细胞增殖活性,流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR检测VCAM-1mRNA表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞间黏附分子(VCAM-1)及血管细胞黏附分子(ICAM-1)的表达情况。结果:当As2O3浓度在3μmol.L-1时HUVEC培养24 h的的凋亡率为(0.134±0.03)%,48 h为(3.305±0.53)%,72 h为(3.748±0.84)%(P<0.05),凋亡率均在一较低水平。当As2O3浓度>3μmol.L-1时HUVEC凋亡率明显增加(P<0.01)。不同浓度As2O3作用HUVEC48 h后检测上清液中ICAM-1与VCAM-1浓度时发现1μmol.L-1时VCAM-1表达即开始增加(123.32±3.78 mmol.L-1,P<0.01),而HUVEC表达ICAM-1含量与对照组相比差异并不明显(38.94±2.59 mmol.L-1,P>0.05),随着As2O3浓度的增加,HUVEC表达ICAM-1/VCAM-1的量均增加但敏感性不同。对照组及(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0)μmol.L-1As2O3作用于HUVEC 48 h实时荧光定量PCR法检测VCAM-1mRNA表达量明显增加,与对照组相比实验组的表达量分别为(1.657±0.287,1.858±0.241,2.321±0.280,3.012±0.235,3.508±0.342)(P<0.01)。结论:As2O3可直接降低细胞活性,诱导细胞凋亡,并且呈一定的时间-浓度依赖性。在较低浓度时VCAM-1/ICAM-1的表达在一个相对较低的水平,随着As2O3浓度的逐渐升高,内皮细胞凋亡率增高,VCAM-1/ICAM-1表达增加,并且VCAM-1/ICAM-1对As2O3的敏感性呈现一定的差异性。     

GLP-1对人脐静脉内皮细胞释放NO的影响及机制的研究

目的:观察胰高糖素样肽-1(GLP-1)对脐静脉内皮细胞(HUVECs)释放一氧化氮(NO)的影响,并探讨GLP-1受体及GLP-1(9-36)在其中的作用。方法:分别以GLP-1、艾塞那肽、GLP-1(9-36)、GLP-1+exendin(9-39)、GLP-1+西格列汀、GLP-1+西格列汀+exendin(9-39)孵育HUVECs,取培养上清以硝酸还原酶法检测NO浓度。结果:GLP-1剂量依赖性的增加HUVECs中NO释放,艾塞那肽和GLP-1(9-36)均可刺激NO释放,exendin(9-39)和西格列汀均可部分阻断GLP-1引起的NO释放。结论:GLP-1可能通过GLP-1受体及GLP-1(9-36)相关的途径刺激HUVECs NO释放,发挥直接的血管保护作用。     

人脐静脉内皮细胞的生物学特性及细胞内信号转导机制

本实验对人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）合成与释放篾这活性多肽（ＶＰｓ）及其作用机制进行了研究。结果表明：（１）无神经支配的人脐血管内皮细胞（ＶＥＣ）所含ＶＰｓ较有神经支配的肠系膜血管ＶＥＣ多;（２）这些ＶＰＳ是ＶＥＣ自身合成且能释放到胞外;（３）血管活性肠肽（ＶＩＰ）和Ｐ物质（ＳＰ）使ＨＵＶＥＣ膜上Ｃａ＾２＋通道开放概率明显增加,生长抑制（ＳＯＭ）使其明显降低,但它们均使胞浆内「Ｃａ＾２＋」和ＣＡ     

同型半胱氨酸对人脐静脉血管内皮细胞tPA 及PAI-1基因表达的影响

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)对纤溶系统的影响,观察Hcy在转录水平对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)的影响。方法将体外培养的HUVEC分为生理浓度(10μmol/LHcy)组,病理浓度(50、200、500μmol/L)Hcy组及单纯培养基组(0μmol/LHcy),培养24h后,提取RNA,反转录聚合酶链反应分析(RTPCR)法分析各组tPA及PAI1基因表达水平。结果500μmol/LHcy组与10μmol/LHcy组相比,tPAmRNA基因表达明显下调(P<0.05),PAI1mRNA表达则明显上调(P<0.05)。而与单纯培养基组相比,10μmol/LHcy组tPAmRNA表达明显增高(P<0.05)。结论生理浓度Hcy可以增加纤溶系统活性,减少血栓性疾病的发生。高Hcy(病理浓度)则抑制纤溶系统活性,促进缺血性心脑血管疾病的发生。     

裂解型腺病毒Ad-E1A对人脐静脉内皮细胞的影响

以QBI-293A细胞基因组DNA为模板,PCR扩增E1A基因,酶切连接到pAdTrack-CMV转移质粒上,pAdTrack-CMV-E1A经PmeI线性化后,与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-E1A,经PacI线性化,脂质体转染QBI-293A细胞,获得裂解型腺病毒Ad-E1A。裂解型腺病毒Ad-E1A在ECV304细胞内复制裂解,抑制细胞的生长,并可以降低VEGF的表达,探讨了Ad-E1A可能通过抑制ECV304细胞NF-κB的激活而引起细胞生长抑制的机制,说明Ad-E1A具有抑制肿瘤转移的功能。     

趋化因子CCL2对人脐静脉内皮细胞ICAM-1 表达的影响

目的:探讨CC类趋化因子配体2(C-C motif ligand 2,CCL2)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达的影响。方法:体外分离培养HUVECs细胞,将HUVECs铺至6孔板中,待细胞融合至80-90%时,将CCL2过表达载体[pc DNA3.1(+)-CCL2]及CCL2小分子干扰RNA(si-RNA)分别转染到HUVECs中,于转染后12 h、24 h和48 h收集细胞进行RNA及蛋白提取。荧光定量PCR方法检测HUVECs中CCL2及ICAM-1基因m RNA表达。Western blotting检测HUVECs中CCL2及ICAM-1蛋白表达。结果:(1)与pc DNA3.1(+)组相比较,pc DNA3.1(+)-CCL2组中CCL2基因m RNA和蛋白水平均显著升高;与si-Control组相比较,si-CCL2组中CCL2基因m RNA和蛋白表达均明显下降。(2)与对照组比较,pc DNA3.1(+)-CCL2组明显增加HUVECs中ICAM-1的m RNA及蛋白表达,而si-CCL2组显著抑制HUVECs中ICAM-1的m RNA及蛋白表达。结论:CCL2能增加HUVECs中ICAM-1基因m RNA和蛋白表达,为深入认识动脉粥样硬化的发病机制提供了理论依据。     

TWIST1在人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及血管形成中的作用

探讨TWIST1在原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）增殖、迁移及体外血管生成中的作用。用有靶向人TWIST1基因shRNA（pLL3.7-shTwist1-GFP）的慢病毒液感染试验组细胞,同时以携带Scramble shRNA的慢病毒液（pLL3.7-shCtrl-GFP）感染对照组细胞,用流式细胞术测定细胞感染效率,实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR）检测shRNA的基因沉默效率。通过制作细胞生长曲线、Annexin V/7AAD染色流式细胞术、细胞划痕实验、小管形成实验、qRT-PCR检测TWIST1表达降低对HUVECs的增殖、凋亡、迁移、血管形成能力以及血管生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2）基因表达的影响。试验组TWIST1基因表达下降为对照组的30%,表明shTWIST1能有效降低TWIST1基因的表达。与对照组相比,敲降TWIST1能明显抑制HUVECs的增殖（P<0.01）,诱导细胞凋亡（P<0.05）。试验组HUVECs划痕愈合率、体外生成的血管样结构数目和总小管分支长度均显著低于对照组（P<0.01）;与对照组相比,试验组HUVECs中VEGFR2的表达显著降低（P<0.01）。通过探究HUVECs表达的TWIST1在内皮细胞增殖、存活、迁移和毛细血管样结构的形成中的作用,为TWIST1作为抑制肿瘤血管新生治疗的新靶点提供一定的理论依据。     

胞内钙与蛋白激酶C对人脐静脉内皮细胞组织因子途径抑制物及组织因子表达的影响

为探讨细胞内钙及蛋白激酶C在血管内皮细胞释放组织因子（TF）,组织因子途径抑制物（TFPI）中的作用,本文采用钙离子载入剂A23187与蛋白激酶C激动剂佛波脂（PMA）刺激原代培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,观察各实验组内皮细胞冻融液中TF活性及条件培养液中TFPI活性的变化,以一期凝固法测TF活性,二期生色法测定TFPI活性。结果显示：A23187,PMA及A23187＋PMA组TF活性较对照明显升高（P＜0.001）,三组中A23187和A23187＋PMA组活性明显低于PMA组（P＜0．05）,但前两组间无显著性差异（P＞0．05）;A23187组TFPI活性与对照无明显差别,但PMA与A23187＋PMA组TFPI活性较对照及A23187组明显升高（P＜0.01）。结果提示：细胞内钙升高及PKC激活促进血管内皮细胞TF的合成,以PKC为强;PKC促进血管内皮细胞释放TFPI,而钙对此无明显作用。     

胞浆型磷脂酶A2介导弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

探讨弱氧化修饰低密度脂蛋白(MM-LDL)能否诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡以及胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)在此过程中的作用.MTT法测定细胞存活率;相差显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡;3H-花生四烯酸(3H-AA)预标法测定PLA2活性;蛋白质印迹检测cPLA2磷酸化;激光共聚焦显微镜检测单个细胞内钙离子浓度的变化.结果表明,MM-LDL(100～300 mg/L)作用后的HUVECs呈现凋亡典型的形态特征,凋亡率随MM-LDL浓度的增加而上升.MM-LDL能引起胞内钙离子浓度增加,cPLA2的活化及磷酸化.15 μmol/L AACOCF3和5 mmol/L EGTA在抑制cPLA2活性的同时,部分抑制MM-LDL诱导的HUVECs凋亡.加入外源性AA(50 μmol/L)能逆转AACOCF3引起的凋亡抑制.结果提示,cPLA2参与了MM-LDL诱导HUVECs凋亡的信号传递.     

PES1蛋白与雄激素受体的相互作用及定位

目的:研究PES1蛋白与雄激素受体(AR)之间的相互作用。方法:利用免疫共沉淀实验检测PES1蛋白与AR之间的相互作用,并进行相互作用定位;利用Western印迹研究PES1对乳腺癌细胞内AR表达水平的影响。结果:免疫共沉淀实验显示PES1蛋白与AR存在相互作用;PES1蛋白的1~110、111~220、221~320和311~588氨基酸残基(aa)区域均能与AR结合,415~588 aa不能结合AR;AR的651~918 aa区域与PES1结合。PES1不能调节乳腺癌细胞AR的表达水平。结论:PES1多个区域均能与AR相互作用,并且主要结合在AR的转录激活结构域2,为进一步探讨PES1对AR功能的调节奠定了基础。     

心肌梗死大鼠钙敏感受体表达与心肌细胞凋亡的变化

目的:观察大鼠急性心肌梗死后不同时间心肌钙敏感受体(CaSR)的表达和心肌细胞凋亡的变化情况。方法:健康Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham)和心肌梗死(AMI)组,通过结扎左侧冠状动脉前降支的方法,建立大鼠心肌梗死模型,分别在手术后1、2、4周(每组成功存活n=5)检测心脏形态学和血流动力学的改变,检测心肌组织中CaSRmRNA和蛋白的表达,以及Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9蛋白的表达,检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性和肌钙蛋白(cTnT)水平,观察心肌细胞凋亡情况。结果:和Sham组相比,随着心肌梗死的发展,AMI组大鼠心肌组织CaSR的mRNA和蛋白的表达、细胞凋亡指数均明显增加(P<0.05),心肌细胞超微结构损伤严重;左心室收缩压(LVSP)、左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)(mmHg/s)和最大下降速率(-dp/dtmax)(mmHg/s)减少,左心室舒张末期压(LVEDP)明显增大(P<0.05);AMI组血清cTnT水平、CK和LDH活性均升高(P<0.05),随着心肌梗死的发展,cTnT水平和CK活性逐渐降低,LDH变化不明显。心肌组织中促凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、caspase-9表达增多,抑制凋亡的相关蛋白(或因子)Bcl-2表达减少(P<0.05)。结论:随着AMI的发展,AMI组大鼠心肌组织中CaSR的mRNA和蛋白的表达增多,细胞凋亡数增加,表明CaSR参与了心肌梗死的发展,其机制可能与促进细胞凋亡有关。     

大蒜素激活SIRT1通路抑制过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞的衰老

Sirtuin1(SIRT1)活性的异常与血管内皮细胞的衰老密切相关。大蒜素作为一种生物活性分子具有抗氧化、抗炎及调脂作用,然而目前尚未见关于大蒜素与SIRT1的活性调节的报道。本研究旨在阐明大蒜素对过氧化氢（H2O2）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）衰老的影响,以及Sirtuin1(SIRT1)在其中的作用。SA-β-gal染色及活性氧检测提示,与对照组相比,大蒜素明显减少H2O2诱导半乳糖苷酶阳性细胞数及活性氧的产生。用Western印迹、MTT、RT-PCR及SIRT1活化检测对SIRT1、p-SIRT1、PAI-1的蛋白质、SIRT1mRNA表达及细胞活力进行检测,结果显示,大蒜素可以逆转H2O2诱导的PAI-1表达的升高、SIRT1磷酸化及活性的降低,并且上调细胞的活力。当采用SIRT1抑制剂NAM处理后,大蒜素的这些作用均被阻断。以上结果表明,大蒜素通过激活SIRT1抑制H2O2诱导的HUVECs ROS的产生、活力的下降及细胞的衰老。     

天然和氧化低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞VCAM-1表达的影响

目的探讨天然和氧化低密度脂蛋白(n-LDL,ox-LDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)VCAM-1表达的影响。方法将n-LDL,ox-LDL作用于培养的HUVEC,用细胞酶联免疫吸附试验(cellELISA)检测VCAM-1蛋白的表达,用原位分子杂交技术检测VCAM-1 mRNA的表达。结果正常培养的HUVEC可表达VCAM-1,n-LDL和ox-LDL均可增强培养的HUVEC表达VCAM-1,尤以ox-LDL作用更明显。结论n-LDL、ox-LDL可能通过促进血管内皮细胞表达VCAM-1而在动脉粥样硬化的早期事件中起作用。     

PKCβ/p66Shc介导高尿素引起的人脐静脉内皮细胞ROS的产生

目的探讨PKCβ/p66Shc通路在高浓度尿素引起的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生中的作用。方法体外培养HUVECs,分为正常对照组、甘露醇组、尿素组和尿素+LY333531(PKCβ抑制剂)组。采用CCK8法检测高浓度尿素对细胞活性的影响,倒置显微镜观察细胞形态改变;DCFH-DA法检测细胞内ROS含量;Western blot检测细胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平;免疫荧光技术观察细胞内p-p66Shc水平。结果 25mmol/L尿素明显抑制HUVECs活力,并引起细胞排列紊乱、细胞间隙增大、铺路石样排列结构受到破坏等形态学改变。与对照组相比,25mmol/L尿素引起细胞内ROS水平明显升高,在6h达到峰值;加入PKCβ抑制剂LY333531后ROS水平明显降低。Western blot结果显示,25mmol/L尿素诱导p66Shc、p-p66Shc、PKCβ和p-PKCβ水平随作用时间的延长而逐渐增加。25mmol/L尿素负荷6h后可见细胞胞质内p-p66Shc免疫反应性明显增强,LY333531可阻断该作用;Western blot检测也显示LY333531可显著抑制高浓度尿素对p-p66Shc水平的上调。结论 PKCβ/p66Shc信号通路是高浓度尿素诱导HUVECs内ROS产生的重要途径。