蛋白激酶C在小鼠卵母细胞体外成熟和受精中的作用

蛋白激酶是一类重要的丝／苏氨酸蛋白激酶。本实验以小鼠为实验动物,研究了PKC在卵母细胞体外成熟、活化和受精中的可能作用,及两种PKC亚型在卵母细胞中的定位。PKC激活剂PMA可以阻止GV期卵母细胞在体外恢复减数分裂,该作用可被PKC抑制剂CalphostinC抵消,但不能被PLCγ抑制剂U73122或PKCδ专一性抑制剂Rottlerin所克服。Western印迹显示PKCα和βI在卵母细胞发育过程中恒量表达。激光共聚焦显微术研究发现,受精或受到活化刺激后PKCα转位到卵母细胞膜上,同时皮质颗粒排放,说明PKCα可能参与调节卵皮质反应。本实验首次在小鼠中研究了PLCγ与受精的关系,发现不存在PKC对PLCγ的正反馈调节。此外,本研究还对小鼠卵巢中对PKCα和βI进行了蛋白定位研究。     

用激光共聚焦显微术在小鼠卵母细胞中检测蛋白激酶C

用免疫荧光化学与激光共聚焦显微术结合的方法研究了小鼠卵母细胞中蛋白激酶C(PKC)α和βⅠ的表达和定位,以及蛋白激酶C(PKC)和皮质颗粒的双标记,探讨了以哺乳动物卵母细胞为实验对象进行免疫荧光共聚焦显微研究的简便方法.结果发现,PKC α和βⅠ在小鼠生发泡期和MⅡ期卵母细胞中都有表达,但表达部位存在差异.说明采用改进的激光共聚焦显微术,可以方便、灵敏地检测特异蛋白质在卵母细胞中的表达部位,从而为生殖、发育研究提供有效手段.     

蛋白激酶在卵母细胞减数分裂和受精中的作用

脊椎动物卵母细胞的减数分裂和受精过程受到多种蛋白激酶的调节。近年来对于卵母细胞成熟、活化和受精的分子机制研究取得了长足进步 ,发现促成熟因子 (MPF)和促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)是调节卵母细胞细胞周期的关键分子 ,二者的激活和失活导致了减数分裂的恢复、阻滞和完成。许多蛋白激酶通过调节MPF和MAPK活性来影响减数分裂。Polo like激酶活化MPF ,Mos激活MAPK而启动成熟分裂并维持中期阻滞。CaMKII通过泛素途径灭活MPF使卵突破MII期阻滞。另外 ,p90 rsk作为MAPK的下游分子参与减数分裂调节 ,蛋白激酶C(PKC)诱导皮质颗粒排放并抑制MAPK激活 ,酪氨酸蛋白激酶家族成员介导受精诱发的Ca2 释放。这些蛋白激酶的协同作用推动了卵母细胞正常的成熟与受精     

钙离子和冈田酸对亚胺环己酮诱导小鼠卵子孤雌激活的影响

哺乳动物卵母细胞在排卵后停滞在第二次减数分裂中期,受精和多种物理或是化学刺激可以克服这一阻滞使卵母细胞活化。蛋白合成抑制剂亚胺环己酮可以诱导小鼠卵母细胞发生孤雌活化,但其机制尚未完全阐明。以前的研究提示亚胺环己酮可能是通过抑制蛋白激酶MOS的合成来发挥孤雌激活的作用的。本实验发现,CHX诱导的卵母细胞孤雌活化是Ca^2 依赖性,其效率可被钙离子载体A23187大大提高,免疫蛋白印迹结果表明,卵母细胞孤雌活化后MAPK发生去磷酸化。蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸可以克服CHX＋A23187对小鼠放母细胞活化作用,并且部分阻止MAPK去磷酸化。以上结果表明,抑制MOS的合成并非CHX诱导的孤雌活化过程的惟一原因,并且蛋白磷酸酶抑制剂可以阻断这一激活事件。     

双歧杆菌DNA对巨噬细胞PKC的影响

目的探索青春型双歧杆菌的DNA对巨噬细胞PKC家族的影响.方法以激光共聚焦显微镜定量测定小鼠腹腔巨噬细胞PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ、PKCε和PKCζ的含量.结果双歧杆菌DNA注射组小鼠腹腔巨噬细胞PKCα和PKCβⅡ的平均荧光强度明显高于对照组（P＜0.01）,而PKCβⅠ、PKCγ、PKCε和PKCζ的平均荧光强度在2组间则差异无显著性（P＞0.05）.结论青春型双歧杆菌的DNA能活化巨噬细胞的PKCα和PKCβⅡ.     

蛋白激酶C_ζ对小鼠受精卵发育早期基因组转录活化的影响

为研究蛋白激酶Cζ (proteinkinaseCζ ,PKCζ)在小鼠受精卵细胞早期发育过程中对胚胎基因组活化影响 ,采用免疫印迹和细胞免疫荧光的方法 ,观察PKCζ的抑制剂对小鼠受精卵 1 细胞期G1和G2 不同时期小鼠受精卵基因组活化的影响 .小鼠 1 细胞期受精卵蛋白激酶C (PKC)的活性不断增加 ,并在G2 期达到最高 .PKC的抑制剂calphostinC可以明显抑制PKC的活性达 4 7% .同时calphostinC对受精卵 1 细胞期基因组的早期活化具有显著的抑制作用 (P <0 0 1) .在小鼠 1 细胞期受精卵的G2 期 ,具有活性的磷酸化PKCζ的含量明显多于G1期和卵母细胞MⅡ期 ,分别比它们高2 7%和 110 % .PKCζ的特异性抑制剂可以抑制受精卵 1 细胞期基因的转录和活化 (P <0 0 5 ) .实验结果表明 ,PKCζ参与了小鼠受精卵基因组早期转录的调控     

PKCγ免疫反应定位小鼠皮质脊髓束的实验研究

目的探讨显示皮质脊髓束在成年小鼠脑和脊髓中定位分布的简便有效方法。方法运用蛋白激酶Cγ（PKCγ）免疫组织化学染色法,观察成年ICR小鼠脑和脊髓中皮质脊髓束的定位和分布情况。结果PKCγ免疫阳性产物分布于大脑运动皮层第V层锥体细胞胞体和轴突中,锥体细胞的阳性纤维经内囊、中脑大脑脚底、脑桥基底部、下行至延髓锥体中。在延髓下段,PKCγ阳性纤维经锥体交叉后进入对侧脊髓灰质后联合背侧,形成背侧皮质脊髓束,在脊髓白质的后索腹侧深层下行,至骶髓3-4节段以下逐渐消失。在整个脊髓前索和外侧索中未见有PKCγ阳性纤维。结论PKCγ特异地表达于脊髓后索皮质脊髓束中,提示PKCγ免疫组织化学法是一种显示和观察皮质脊髓束精确定位的有效方法。     

蛋白激酶C蛋白质抑制剂对细胞增殖的影响

在生物体内许多不同组织细胞中陆续发现存在有蛋白激酶C(PKC)的内源性蛋白质类抑制剂.应用某些PKC抑制剂所作的研究结果表明,PKC抑制剂能够促进神经母细胞瘤细胞的分化,促进脑损伤后轴突的再生和功能的恢复,抑制细胞的生长,特别是对癌细胞的生长抑制和细胞毒性尤为明显,而在精子中发现的PKC抑制剂可能在受精或受精卵发育过程中起某种十分重要的作用.     

蛋白激酶B在小鼠1-细胞期受精卵中活性及表达变化

蛋白激酶B(proteinkinaseB ,PKB)发现于 1991年 ,属于丝 苏氨酸蛋白激酶 .因其激酶活性区的氨基酸序列与蛋白激酶C (proteinkinaseC ,PKC)和蛋白激酶A (proteinkinaseA ,PKA)同源性分别为 73%和 6 8% ,因此命名为PKB ,或PKA和PKC相关激酶(relatedtheAandCkinase ,RACK) [1] .另外 ,PKB被证明为逆转录病毒的癌基因v akt编码的蛋白产物 ,因此PKB又称AKT[2 ] .PKB分子量 6 0kD ,目前已知分为PKBα、β、γ三种 .PKBα广泛存在于机体各组织中 ,其活性受多种信息物质调节 .PKBβ在卵巢癌、胰腺癌细胞中过表达 ,PKBγ在大…     

钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ在卵母细胞减数分裂和受精中的作用

钙调蛋白依赖的蛋白激酶 (CaMK)是一类分布广泛的丝 /苏氨酸蛋白激酶家族 ,在钙离子和钙调蛋白存在的条件下发生自磷酸化而被激活 ,在细胞内对于钙信号的传递具有重要的介导作用 .近年来的研究表明CaMKⅡ是参与调节卵母细胞减数分裂的重要分子 ,在卵母细胞成熟、极体排放、受精和活化等过程中发挥作用 .CaMKⅡ作为Ca2 的下游信号分子 ,在受精后促进成熟促进因子 (MPF)和细胞静止因子 (CSF)的失活 ,并调节纺锤体微管的组装和中心体的复制过程 .虽然CaMKⅡ在减数分裂中的作用广泛而关键 ,但目前的研究主要集中于低等动物和小鼠 ,今后有待进一步阐明该蛋白激酶在其他哺乳动物中的作用和调节机制     

小鼠对天花粉蛋白体内及体外免疫应答的基本特点

C 57 BL/6 J小鼠在应用弗氏全佐剂或铝矾为佐剂结合天花粉蛋白免疫后都能引起抗原特异的IgE类抗体的反应以及其它Ig类抗体的反应;IgE的滴度和总的抗天花粉蛋白抗体的滴度的动态变化趋势基本一致,但并不完全同步。IgE类上升得较IgG等类抗体为慢,但上升的速度要快。脾和肠系膜淋巴结细胞分泌抗体的动态变化也和血清并不完全一致。天花粉蛋白在一定浓度下能抑制小鼠T淋巴细胞在体外的抗原特异的增殖反应和ConA反应。这抑制并不限于增殖过程的启动。补充外源性的IL-2也不能消除这抑制作用。天花粉蛋白加热变性后丧失了对小鼠淋巴细胞的毒性,并能引起经未变性天花粉蛋白体内致敏的小鼠的T淋巴细胞在体外的明显增殖。应用微量的天花粉蛋白为抗原,以及少量的无凝集素的conA条件培液等能在体外诱发致敏的B淋巴细胞产生二次抗体应答。     

对果蝇S期细胞内组蛋白基因的原位定量分析

利用微型计算机控制的荧光显微镜、荧光强度检测仪和图像记录装置并结合荧光原位杂交法对果蝇细胞核内组蛋白基因的复制时期进行了研究,从而建立了一套细胞内直接定量分析的方法。根据果蝇胚胎原代培养细胞核的DAPI染色强度确定处于S期的细胞。用杂交信号的荧光强度与细胞核荧光强度的相关关系来反映组蛋白基因的复制时期。结果表明果蝇组蛋白基因的复制是在DNA合成早期进行的。这套方法至少可直接在细胞上对每套基因组100以上拷贝数的熏复DNA序列进行有效的定量分析。     

内分泌细胞中溶酶体对激素分泌调节的作用

本实验用外源性雄激素引起垂体促性腺激素细胞和睾丸间质细胞分泌抑制,对这两种细胞中的溶酶体及分泌吞噬和自体吞噬活动进行了超微结构形态观察和半定量分析。实验中应用了CMP酶细胞化学技术和免疫胶体金技术。研究结果显示,在分泌受抑制状态下,垂体促性腺激素细胞中溶酶体增多,分泌吞噬活动加强;与此同时,睾丸间质细胞也表现溶酶体增多、自体吞噬活动加强。这些结果不仅再次证明在分泌蛋白质激素细胞中溶酶体以分泌吞噬的方式参与了激素分泌调节,更重要的是初步证明在分泌类固醇激素细胞的分泌调节中,也有溶酶体的参与,其形式是自体吞噬作用。细胞通过自体吞噬作用得以在短时间内清除一部分合成激素的细胞器和其中的激素,这可能是分泌类固醇激素的细胞及时有效地调整激素分泌量的一项重要机制,与分泌蛋白质激素细胞的分泌吞噬有着相同的意义。     

烟草合子与二胞原胚在离体培养中的发育

用酶解-研磨法分离烟草与大叶烟草受精后的胚囊,继之以显微解剖分离合子与二胞原胚。将3—5个合子或二胞原胚置于微室的琼脂糖小滴中,以预先培养3—4天、分裂1—2次的烟草、大叶烟草或黄花烟草叶肉原生质体饲养。培养基为KM8p与其它附加成分。在25℃与黑暗下静置培养。培养3—4天,约60%合子完成第一次分裂。多数行不等分裂产生大小两个细胞。12天后形成少数原胚或多细胞团。二胞原胚培养亦分裂为多细胞原胚。研究了合子分离方法、合子发育时期、饲养细胞种类与培养天数等因素对合子离体发育的影响。     

arg-13可能参与鸟氨酸在粗糙脉孢霉线粒体的过膜转运(英文)

arg-13为精氨酸代谢途径里的一个渗露型突变。经研究发展了该突变的严格选择方法。该法省略了基本培养基的氮源而加上相似浓度的鸟氨酸与赖氨酸。此法在严紧山梨糖/葡萄糖条件下能强烈抑制arg-13突变株生长,但在斑点试验条件下允许arg-13突变株生长。由于鸟氨酸是通过线粒体合成和由细胞质至线粒体的过膜转运而积累,我们构建了arg-4,arg-13双突变株,其中arg-4阻断了线粒体鸟氨酸合成。在斑点试验条件下,arg-4,arg-13双突变株能利用鸟氨酸作为唯一氮源与精氨酸合成前体,但受赖氨酸与刀豆氨酸强烈抑制。具正常鸟氨酸转运功能的arg-4单突变株在鸟氨酸基本培养基的生长只受微弱的赖氨酸抑制。已有报道arg-13为嘧啶合成代谢途径里pyr-3(CPSACT~ )突变的部分抑制基因,序列分析表明arg-13编码一线粒体转运酶。本文数据提示arg-13在线粒体鸟氨酸过膜转运过程中起主要作用。arg-13突变株仍携带一定的线粒体鸟氨酸转运功能并受碱性氨基酸赖氨酸、刀豆氨酸抑制,可能为另一线粒体碱性氨基酸转运酶介导。     

家兔胚泡ICM在体外培养系统中的行为

一、用显微外科方法从兔早期胚泡分离来的ICM在所用的体外培养系统中的行为,因ICM的生长状态而不同。呈带状生长的ICM从近端向远处延伸,而细胞的分化则从远端逐渐向近端进行,它具有明显的极性。细胞的分化秩序井然,层次分明。因此呈带状生长的ICM适用于进行细胞分化和细胞谱系的研究。二、呈团块状生长的ICM,没有明显的极性,细胞分化开始于团块的外表面,逐渐向中央进行。细胞分化开始稍晚一些,速度也较慢,这种生长状态的ICM适用于分离胚胎干细胞。三、兔子胚外内胚层从ICM分化来,它经历了二次分化的过程。第一次发生于培养后第三天(相当于交配后第七天),形成第一胚外内胚层-胚外体壁内胚层,它向远处迁移,远离原始外胚层。培养后四天(相当于交配后第八天),形成第二种胚外内胚层-胚外脏壁内胚层,它尾随体壁内胚层向远处迁移,其后缘的部分细胞向原始外胚层附近的滋胚层下面侵润。四、胚外体壁内胚层和脏壁内胚层的细胞是由少数决定了的和离开ICM的细胞分化和增殖而来。五、文中讨论了早期胚胎细胞分化的谱系问题。     

斑马鱼整胚原位杂交和显微注射转基因技术的建立(简报)

随着人类基因组框架图的完成,解读大量基因的功能和表达调控成为亟待解决的问题。因此通过模式生物从个体水平、细胞水平和分子水平研究基因功能及其表达调控日益成为一个重要的研究领域。斑马鱼(Brachydanio rerio)是近年来崛起的一种模式生物。它的显著优势在于:个体小,便于大批量饲养;产卵量大,胚胎透明,易于观察和操作;体外发育,发育迅速,2—3天即可完成主要器官的建成;可以方便的进行大规模的诱变和突变型筛选等研究。它已成为脊椎动物胚胎发育遗传学和基因功能研究中理想的模式生物。整胚原位杂交技术是     

理化诱变引起的小麦再生株染色体变异

小麦幼胚和愈伤组织经理化诱变后形成的再生株M_1R_1和C_1R_1,具有比R_1株高的染色体变异频率,其染色体数目变化于35—46之间,但无倍数变异。理化诱变处理提高了再生株中含非整倍体、棒状二价体、单价体、等臂环和四价体的细胞频率,其中以1000伦琴γ射线照射未成熟胚处理的再生株染色体变异频率为最高。其次为2 mmol/L叠氮化钠处理愈伤组织的再生株。经过二倍体和单倍体选择,染色体变异大为减少,但仍保有较高频率的单价体。     

核体(Karyoplast,细胞去核产物)合成RNA的能力

近十年来由于细胞松弛素B(Cyto-chalasin B,以下简称CB)引起细胞群体去核的方法的建立和不断完善,为细胞核与质的相互作用关系研究提供了一个新的实验手段。为详尽地了解CB处理细胞所获的核体和胞质体的特性,以便利用其进行核质关系方面的研究,我们利用显微与电镜放射自显影技术对CB处理所获各类核体作了RNA代谢的研究。核体(Karyoplast)是外面包被着细胞质膜并带有不同量胞质的细胞核,核体本身就是研究细胞核与质相互关系的好材料。通过对核体的研究,可从中探讨大分     

沙冬青冬季叶绿体的超微结构特征

沙冬青在冬季的叶肉细胞中有丰富的叶绿体,经常聚集在一起,相互重叠,相互嵌合,有的还相互融合。大部分叶绿体为凸透镜形,多余叶绿体主要为V形、蝶形、连婴形和哑铃形。它们的被膜不光滑,常凹凸不平,甚至出现突起和内陷。类囊体十分发达,质体小球很多,但淀粉粒缺乏。大部分叶绿体形态结构正常,有的还在出芽和分裂。少数叶绿体与此不同,它们已经衰老,其中一些正在解体或已经解体。