拟南芥γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)启动子的分离及表达特性分析

维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,具有重要的生理功能。γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成α、β-生育酚。从拟南芥中分离了γ-生育酚甲基转移酶基因1552bp的启动子序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的叶、茎以及花均有表达,且在茎尖、雄蕊和幼叶中表达最强,而在根、种子和种荚中则没有检测到GUS基因的表达,表明γ-TMT基因可能仅在拟南芥某些组织中特异性高表达。     

甘蓝型油菜γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆和功能验证

采用RACE技术,从甘蓝型油菜中克隆出一含1044个碱基的开放阅读框架的γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因全长cDNA。将其成熟蛋白编码区克隆进pET21b( )多克隆位点,在大肠杆菌BL21(DE3)CodonPlus中表达出一个分子量为36kDa的融合蛋白。酶学分析显示,重组酶具有γ-TMT活性。     

拟南芥γ-生育酚甲基转移酶 （γ-TMT）启动子的分离及表达特性分

维生素E是一类人体所必需的脂溶性的维生素,具有重要的生理功能。Γ-生育酚甲基转移酶（γTMT）是维生素E生物合成途径中的关键酶之一,催化γ、δ-生育酚甲基化,生成α、β-生育酚。从拟南芥中分离了γ-生育酚甲基转移酶基因1552bp的启动子序列,构建了含有该启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了转基因植株。GUS组织化学染色结果表明,在γ-TMT启动子的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的叶、茎以及花均有表达,且在茎尖、雄蕊和幼叶中表达最强,而在根、种子和种荚中则没有检测到GUS基因的表达,表明γ-TMT基因可能仅在拟南芥某些组织中特异性高表达。     

大豆GmAKT1基因的克隆及其正反义植物表达载体构建

本研究利用同源克隆的方法从东农50中克隆得到一个钾离子通道相关基因,命名为GmA KT1。生物信息学分析Gm AKT1含有一个长2 628 bp的开放阅读框,编码875个氨基酸,推测为亲水跨膜蛋白。组织特异性表达分析发现GmA KT1在大豆根部表达量最高。根据TA连接特征将克隆片段分别正向、反向插入PCXSN-1250载体,得到植物过表达载体PCXSN-GmA KT1(+)及反义表达载体PCXSN-GmA KT1(-),为进一步研究大豆GmA KT1的转化、分析功能,及改良大豆品种提供科学依据。     

大豆β-伴大豆球蛋白基因启动子的克隆及功能分析

通过PCR技术从三个栽培大豆（南农99-10、N2899和南农88－1）和两个野生大豆（江浦野生豆－1和ZYD4174）的基因组中分离到大豆7S蛋白α亚基基因启动子片段(7SαP),序列分析表明：7SαP片段包含多个种子特异性启动子所特有的序列元件,如RY重复序列、ACGT、AGCCCCA等,而这五个大豆材料的7SαP序列的同源性达99%。将从南农99-10中克隆的启动子片段与pBI121-GFP连接构建表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥。Southern结果显示, 7SαP 片段和报告基因GFP以单拷贝的形式整合到拟南芥基因组中,且GFP在7SαP驱动下获得了种子特异性表达。     

种子特异性启动子（napinB promoter）分离，表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子,序列分析表明,扩增片段（nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97％,将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草,PCR,Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA,获得了转基因植株。     

种子特异性启动子(napinB promoter)分离、表达载体构建及转基因植物获得

利用PCR技术从油菜Brassica napus H165基因组DNA中分离了napinB启动子。序列分析表明,扩增片段(nap300)与文献报道的napinB启动子相应区域的同源性为97%。将其与gus连接构建种子特异性表达载体,农杆菌介导转化烟草。PCR、Southern结果显示,nap300已整合到烟草基因组DNA中,获得了转基因植株。     

玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3 (AP3)在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育.研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子.因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用.本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥(Arabido-psis thaliana) AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plus DNA聚合酶扩增了长度为1 767 bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其GenBank登录号为FJ619533.Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18 (AL132971) 9 264～11 030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白(CAB81799),说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子.PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等.本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3::GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础.     

灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8（LZ-8）基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。     

种子特异表达异源DGAT1基因提高大豆种子含油量和营养品质

为提高大豆Glycine max种子含油量和营养品质,文中以二酰甘油酰基转移酶1(Diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1)基因为遗传修饰靶标。将来自高油植物斑鸠菊Vernonia galamensis L.编码DGAT1酶蛋白的c DNA克隆Vg DGAT1A在大豆种子特异超表达。连续选择获得高代(T7)Vg DGAT1A转基因大豆株系。转基因株系表型鉴定显示,在大豆种子发育中期(30–45 DAF),Vg DGAT1A高表达,相应地DGAT酶活性是非转基因野生型和空载体转化对照的7.8倍。转基因成熟种子含油量比对照提高了5.1%,淀粉含量比对照减少2%–3%,蛋白质含量与对照无显著差异。此外,转基因大豆种子百粒重(14.5 g)和种子萌发率(95.6%)与对照亦无明显差异。种子油脂脂肪酸成分分析显示,转基因大豆种子油中抗氧化的油酸(C18:1Δ9)含量比对照提高8.2%,相应地易氧化的亚油酸(C18:2Δ9,12)和亚麻酸(C18:3Δ9,12,15)分别减少6%和2%。这些数据表明,种子特异超表达外源Vg DGAT1A基因,打破了大豆种子含油量和蛋白质含量的负连锁,显著提高种子含油量且未导致蛋白含量降低。转基因大豆种子重量和萌发率亦未显负效应,而且种子油脂抗氧化性和营养品质得以改善。研究表明应用这一高酶活性Vg DGAT1A的基因工程是提高种子含油量和改善油脂品质的一条有效途径。     

玉米蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的克隆及表达载体的构建

利用RT-PCR方法从玉米幼苗叶片总RNA中克隆出玉米的蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因的全长cDNA片段。该片段与文献报道的序列具有99%的同源性。并分别构建了以双CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的植物双元表达载体PBISPS和以Pcab为启动子,以T35S为终止子的植物表达载体PBSPS,其中PBISPS含有NPTⅡ选择标记基因,PBSPS不含选择标记基因。     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物(GSP-1,GSP-2,GSP-3)分别与11个简并引物(AD1-AD11)配对,进行热不对称嵌套PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG,在真空条件下通过农杆菌介导,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织,Gus瞬时表达染色结果显示,该DNA片段具有种子特异的启动子活性?对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

Engineering two mutants of cDNA-encoding G2 subunit of soybean glycinin capable of self-assembly <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis> and rich in methionine

The main goal of this work was to make the cDNA-encoding subunit G2 of soybean glycinin, capable of self-assembly in vitro and rich in methionine residues. Two mutants (pSP65/G4SacG2 and pSP65/G4SacG2HG4) were therefore constructed. The constructed mutants were successfully assembled in vitro into oligomers similar to those occurred in the seed. The successful self-assembly was due to the introduction of Sac fragment of Gy4 (the codons of the first 21 amino acid residues), which reported to be the key element in self-assembly into trimers. The mutant pSP65/G4SacG2HG4 included the acidic chain of Gy4 (HG4), which was previously molecularly modified to have three methionine residues. This mutant will be useful in the efforts to improve the seed quality.     

牦牛Endothelin-1基因CDS序列克隆及其真核表达质粒构建

Endothelin-1主要通过促进血管平滑肌细胞增殖引起血管结构和功能的改变,从而刺激血管收缩,Endothelin-1在动物血管生成和低氧适应等关键发育和生理过程发挥重要的作用。为了进一步探讨高原动物脑Endothelin-1对其极端低氧适应调控的分子机理,本研究对牦牛(Bos grunniens)脑Endothelin-1基因CDS全长序列进行了克隆及其真核表达载体的构建。结果表明,牦牛Endothelin-1基因的CDS全长序列含有一个609bp的开放阅读框,编码202个氨基酸,该蛋白分子量为22.98 kDa,理论等电点（pI）为9.63;成功构建出带有CMV启动子,绿色荧光蛋白标记的牦牛Endothelin-1真核表达质粒pEGFP-C1-Endothelin-1;牦牛Endothelin-1基因CDS全长序列编码的氨基酸序列与黄牛(Bos taurus)、藏羚羊（Pantholop shodgsoni）、绵羊(Ovis aries)、野猪(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的同源性分别为100%、95%、93%、81%、77%、70%;且该氨基酸序列的系统进化情况与其亲缘关系远近一致。因此,我们认为高原动物牦牛Endothelin-1的结构和功能在进化上均具有高度保守性,其在低氧适应中的作用可能是通过表达差异或转录后修饰实现的,且本研究构建的真核表达质粒为进一步探讨该基因在青藏高原动物脑对极端低氧生境适应中的生物学功能及其调控机理提供了支持。     

口蹄疫病毒VP1高效植物表达载体构建及鉴定

采用高保真PCR方法从pGEM-VP1-T质粒扩出VP1基因,定向克隆到含DHA的融合中间载体pUC18-DHA,得到pUC18-VP1-DHA,经测序证实核酸序列正确后,再亚克隆到转化范围广,转化效率高,且含有双增强子的高效植物双元表达载体pGreen0029-GFP上,获得含VP1融合DHA基因的植物双元表达载体pGreen0029-VP1-DHA,采用电击法将含VP1的植物表达载体转入根癌农杆菌G3101中,获得了含VP1基因的双元植物表达载体,为下一步的广范围转基因植物表达研究奠定了基础。     

棉花GhAC01基因植物表达载体构建及拟南芥遗传转化

乙烯参与植物生长发育等许多生理过程,在许多植物细胞中,AcD基因通过促进乙烯合成调控着植物器官的形成发育。研究通过PCR方法从棉花基因组中克隆得到l-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1（GhACO1）基因,并将该基因构建到植物表达载体PBI121中,其中GhACO1基因位于CaMV35S启动子和GUS报告基因之间。通过花滴法将GhACO1基因转化拟南芥,利用卡那霉素对转化植株进行初步筛选,对卡那霉素阳性植株进行进一步的PCR检测和GUS组织化学分析。结果表明：GhACO1基因已经整合到拟南芥基因组中;GUS组织化学分析显示,在转基因拟南芥叶、茎和根中都表现出GUS活性。研究结果为进一步探讨GhACO1的生物学功能和基因工程改良棉花纤维品质奠定了基础。     

转基因鸡生物反应器载体的构建及其表达特性分析

以增强型绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶为报告基因,构建了鸡卵清蛋白启动子表达载体和慢病毒载体,以巨细胞病毒 (Cytomegalovirus,CMV)启动子表达载体为对照,转染或感染鸡原代输卵管上皮细胞、鸡胚成纤维细胞、鼠3T3-L1前脂肪细胞和牛乳腺上皮细胞,通过荧光和酶活性检测,旨在筛选出用于实现转基因鸡生物反应器的高效特异性表达载体。结果发现,鸡卵清蛋白启动子表达载体转染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,没有表现出明显的细胞特异性,且荧光素酶检测结果表明其在各细胞组中表达活性都低于CMV启动子表达载体100倍以上;慢病毒载体感染以上4种细胞后2种标记基因均有表达,在鸡输卵管上皮细胞组感染单个细胞的病毒颗粒 (Multiplicity of infection,MOI) 为20时绿色荧光蛋白表达量就可以达到CMV启动子表达载体的水平。上述结果表明,基于卵清蛋白基因调控序列构建的表达载体无法实现外源基因的高效、特异性表达,而慢病毒载体在表达活性和广泛性上可以用于进行鸡输卵管生物反应器的研究。