白三叶TrFQR1基因克隆与表达分析

采用RACE和RT-PCR方法,克隆白三叶拉丁诺(Trifolium repens cv.‘Ladino’)的cDNA基因序列,命名为TrFQR1,对该序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测TrFQR1的表达模式。结果表明:(1)TrFQR1序列长为1 003bp,开放阅读框为612bp,编码203个氨基酸,该蛋白的理论分子质量21.88kD,等电点为5.96,属于亲水性稳定蛋白,无信号肽,无跨膜结构域,在进化上高度保守,N端11~15位氨基酸和C端112~165位氨基酸是FMN结合位点。(2)TrFQR1表达模式分析显示,白三叶TrFQR1基因对于8种处理均有响应,但不同处理响应不同,其中:用25μmol/L SNP、10mmol/L H_2O_2、5mmol/L CaCl_2处理1.5h以及15%PEG处理3h时,白三叶TrFQR1基因相对表达量显著增加;在200mmol/L NaCl和600μmol/L CdSO4处理下,TrFQR1基因相对表达量随处理时间的增加而增加;4℃处理6h和0.02mmol/L NaHS处理1.5h时,TrFQR1基因相对表达量显著减少。     

北美鹅掌楸LtuFPPS1基因克隆与组织表达分析

法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS)是植物萜类物质合成前体法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)的关键合成酶。为探究北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)萜类合成途径的分子机制,该文利用北美鹅掌楸转录组数据,通过设计特异性引物,采用RACE技术克隆得到LtuFPPS1基因的全长序列并进行生物信息学分析。结果表明:(1) LtuFPPS1基因全长1 460 bp,开放阅读框(ORF)长1 056 bp,编码351个氨基酸,蛋白质分子量为40 589.45 D,等电点为5.19,不稳定系数为43.50,归类为不稳定蛋白; LtuFPPS1基因所编码的蛋白不含信号肽,定位于线粒体,是一种不稳定亲水性蛋白,具有类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域,α-螺旋为其氨基酸序列的主要二级结构。(2)进化树和同源序列分析表明,北美鹅掌楸LtuFPPS1蛋白与乐昌含笑(Michelia chapensis)的FPPS蛋白的亲缘关系更近。(3)组织表达分析结果发现,LtuFPPS1基因在北美鹅掌楸雌蕊中的表达量最高,其高低顺序为雌蕊花芽茎雄蕊萼片叶片花瓣根,据此推测萜类代谢物在花器官中的合成相对较多。综上所述,LtuFPPS1基因为萜类合成酶基因,可为从分子生物学层面探究北美鹅掌楸萜类物质的合成提供一定的理论帮助。     

香菜CsEF 1α基因克隆与表达分析

翻译延伸因子EF 1α(elongation factor 1 alpha)是细胞中最丰富的蛋白质之一,其在确保mRNA正确解码以产生细胞蛋白质方面发挥重要作用。该研究采用RT PCR扩增方法克隆香菜CsEF 1α基因序列,利用生物信息学对CsEF 1α基因结构、序列特征及系统进化等进行分析,并采用qPCR探究CsEF 1α基因在香菜不同生长时期和非生物胁迫下的表达模式,为进一步揭示EF 1α基因调控机制的研究奠定基础。结果显示：(1)成功克隆获得香菜CsEF 1α基因序列;CsEF 1α基因包含1个1 344 bp的开放阅读框,编码447个氨基酸,分子式为C₂₂₀₂H₃₅₄₄N₅₉₄O₆₄₄S₂₀,蛋白质分子量为49.29 kD,等电点为9.12;氨基酸序列组成中赖氨酸数量最多(49个,占11.0%),色氨酸数量最少(3个,占0.7%);属碱性蛋白。(2)CsEF 1α蛋白主要由无规则卷曲(36.91%)和α 螺旋(30.43%)构成,定位于细胞质;系统进化树分析显示,CsEF 1α与胡萝卜、野生番茄、青蒿素和非洲菊的亲缘关系较接近;启动子分析包括4种植物生长发育元件、3种激素响应元件和3种胁迫响应元件。(3)qRT PCR结果显示,CsEF 1α基因的表达量随着香菜生长发育时间的延长而升高,并且与转录丰度的变化一致;CsEF 1α基因对4种不同非生物胁迫的响应表达模式有所差异;随着胁迫时间的延长,在盐胁迫下CsEF 1α基因表现出先升高后降低趋势,而在低温、高温和干旱胁迫下表现出先降低再升高的趋势。研究表明,CsEF 1α基因参与了香菜对非生物胁迫的应答,在香菜生长发育和非生物胁迫中具有重要调控作用。     

龙眼DlPSY基因在根和叶中的表达及其生物信息学分析

为研究八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)基因在龙眼类胡萝卜素合成途径中的作用机制,该文从龙眼转录组数据中筛选获得一个PSY基因,命名为DlPSY,采用生物信息学方法对龙眼PSY蛋白的一级结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、卷曲螺旋、蛋白质结合位点、系统进化树、蛋白质互作等进行分析和预测,并同时运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对DlPSY基因在龙眼根和叶中的差异表达进行分析。结果表明:龙眼DlPSY基因长度为1 260 bp,编码420个氨基酸;生物信息学预测DlPSY蛋白具有Isoprenoid Biosyn C1超家族结构,含有信号肽,为分泌性蛋白,无跨膜结构,是一种可溶性亲水蛋白,定位于膜外; DlPSY蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,具有卷曲螺旋。Ramachandran评估结果表明应用SWISS-MODEL构建的蛋白质三级结构模型可靠,其配体结合位点为344Phe和347Lys。RT-qPCR分析结果表明DlPSY基因在龙眼根和叶中均有表达,叶中表达量高于其在根中的表达量。该研究结果为下一步采用遗传学方法提高龙眼中类胡萝卜素的含量奠定理论基础。     

水曲柳FmPHV基因克隆及在形成层愈伤组织中的表达分析

该研究通过基因克隆获得了水曲柳PHV基因,并命名为FmPHV。生物信息学分析表明,水曲柳FmPHV基因编码区全长为2 112 bp,包含有一个完整的开放阅读框,其编码了一个由703个氨基酸组成的蛋白。亚细胞定位预测其主要存在于叶绿体中,为稳定亲水蛋白。保守域及同源分析表明,FmPHV与油橄榄、芝麻和烟草等物种的同源蛋白保守结构域同源性高达99%。在低温4℃条件下,使用50 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)溶液对水曲柳树皮进行处理,获得了水曲柳形成层细胞,并进一步诱导获得形成层愈伤组织。对FmPHV基因的时空表达模式进行分析表明,FmPHV基因6月表达量最高,同时FmPHV能在芽中高表达,通过树皮获得的不同来源的愈伤组织相互比较可知,FmPHV在来源为形成层分生组织形成层愈伤组织中的表达量显著高于其在其他来源的愈伤组织中的表达。此外,对水曲柳幼苗瞬时过表达FmPHV基因,对其所在通路关键基因的表达特征进行分析,FmPHV瞬时过表达后,生长素相关基因表达下降,细胞分裂素相关基因表达上升,有利于芽的分化。以上结果表明,揭示了水曲柳FmPHV在水曲柳植株生长过程中的表达模式以及FmPHV过表达对芽再生通路各关键基因的调控情况,为研究水曲柳FmPHV调控生长发育的分子机制以及其在生长素和细胞分裂素响应通路中发挥的作用奠定基础。     

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS）基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：（1）RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。（2）生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。（3）利用构建的原核表达载体pET 32a RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni²⁺亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。（4）荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

毛竹APX基因系统进化与表达分析

抗坏血酸过氧化物酶(aseorbate peroxidase, APX)是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一,尤其是叶绿体中清除H₂O₂的关键酶,也是维生素C代谢的主要酶类。该文基于生物信息学方法,利用毛竹的基因组及转录组数据鉴定毛竹中的APX基因家族成员,并对其编码的蛋白基本理化性质、基因结构、启动子元件、系统进化及共线性关系、重复串联基因、GO注释及表达模式进行综合分析,共鉴定出21种编码APX的基因。结果表明:(1)PeAPX基因家族成员多为不稳定疏水蛋白,基因结构、基序及结构域相对较为保守,大多数APX基因具有高度保守的内含子模式。(2)系统进化关系显示毛竹APX基因与水稻APX基因有着较高的同源性关系,PeAPX具有较高的进化保守性。(3)Ka/Ks分析表明PeAPX基因都经历了纯化选择压力,此外在每个APX基因的启动子序列中发现有许多与应激反应和植物激素相关的顺式作用元件,结合表达量分析,表明毛竹APX基因在毛竹生长发育中起着正向促进作用。该研究为进一步了解毛竹APX基因家族基本功能及其抗氧化机制提供了一定的参考,为毛竹APX基因功能的深层次鉴定提供了重要依据。     

地黄C3H基因的克隆及生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶属于植物中最大的蛋白酶细胞色素P450家族之一,在植物生命活动中发挥着重要作用。为了解地黄香豆酸-3-羟化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能,该研究基于地黄代谢组学分析获得KEGG途径中的C3H,采用多重比对在NCBI中获得同源基因的一个保守序列,并基于该保守序列和地黄SRA数据库,采用电子克隆和RT-PCR克隆技术获得地黄C3H基因全长CDS(RgC3H),对其进行生物信息学分析。结果表明:RgC3H基因全长为1 530 bp,且编码一个含509个氨基酸、分子量为57.91 kD、无信号肽的蛋白质; 基于氨基酸序列的结构分析显示,RgC3H有一个保守区域-P450结构域; 系统进化分析结果显示,RgC3H与芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述结果为进一步研究RgC3H基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成途径中的作用奠定了基础。     

‘黄花’梨及其芽变‘绿黄花’梨HHT基因克隆与表达分析

该试验以砂梨品种‘黄花’梨（果皮褐色）及其芽变‘绿黄花’梨（果皮绿色）盛花后第8周的果皮为试材,利用常规PCR和巢式PCR技术克隆了ω 羟基棕榈酸O 阿魏酰转移酶（ω hydroxypalmitate O feruloyl transferase, HHT）基因cDNA的全长,命名为 PpyHHT（登录号为KX131155）。序列分析结果表明,该基因开放阅读框（ORF）为1 335 bp,编码444个氨基酸。生物信息学分析显示,推定的PpyHHT蛋白质相对分子质量为49.91 kD,等电点是4.75,与白梨相似性高达98%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT PCR）表达分析显示,2种梨果皮中 PpyHHT基因在盛花后6~9周的4个转色关键期表达量不断变化,在‘黄花’梨果皮中的表达量明显高于‘绿黄花’梨。推测 PpyHHT基因可能参与砂梨果实褐色/绿色性状的形成。     

大豆GmABI4基因克隆及表达分析

该研究基于大豆基因组数据库,根据拟南芥ABI4蛋白的氨基酸序列,经比对分析,获得了大豆中的2个GmABI4基因,分别命名为GmABI4-1(GenBank登录号为XM_014766551.1)和GmABI4-2(GenBank登录号为NM_001249003)。TMHMM软件和系统进化转录分析表明,这2个基因编码的蛋白均不具有信号肽,二级结构主要以无规则卷曲和延伸链为主;进化树分析表明,大豆GmABI4和野生大豆亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,GmABI4-1与GmABI4-2基因在大豆种子与豆荚中的表达量均高于根、茎、叶、花等其他组织,推测可能与调控大豆种子生命活动相关。     

蒜头果不同部位的营养成分分析

为明确喀斯特珍稀植物蒜头果各部位营养价值特点及开发利用方向，该研究以采自广西河池市巴马县交乐天坑的蒜头果成熟的果实、叶、枝皮和树皮为材料，采用我国食品营养成分国家标准的分析方法，测定其不同部位的基本营养物质、氨基酸和矿物质的种类及含量，并对各部位的氨基酸进行营养价值评价。结果表明：(1)在基本营养成分方面，果皮的灰分含量高于其他部位，为5.7 g·(100 g)^-1;种仁中粗脂肪和蛋白质含量高于其他部位，分别为36.0、14.0 g·(100 g)^-1;叶中维生素C的含量高于其他部位，为33.9 mg·(100 g)^-1;枝皮中粗纤维含量高于其他部位，为40.5 g·(100 g)^-1;树皮中碳水化合物含量高于其他部位，为78.6 g·(100 g)^-1;只在种仁和叶中检测出挥发油，分别为0.26、0.15 mL·(100 g)^-1。(2)在蒜头果整体中共检测出16种氨基酸，其中必需氨基酸7种；种仁中氨基酸总量与必需氨基酸总量远高于其他部位，分别为12.7...     

夏枯草PvGGPPS基因的克隆和诱导表达分析

为探究夏枯草中GGPPS基因的生物学特性及功能,该文在夏枯草转录组测序的基础上设计特异性引物,采用逆转录PCR技术获得夏枯草中GGPPS基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析;采用qPCR法分析PvGGPPS基因在不同外源性物质诱导下在夏枯草果穗中的表达量以及该基因在夏枯草不同组织中的表达量。结果表明:PvGGPPS基因开放阅读框1 092 bp,编码363个氨基酸,理论分子量为38 815.68 D,等电点为5.69。PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域。系统进化树表明PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系。qPCR分析表明,PvGGPPS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA3处理组该基因表达量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。该研究结果为进一步研究PvGGPPS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

滇龙胆GrHDR基因的克隆与表达分析

龙胆苦苷(gentiopicroside)是中药龙胆中的主要药效成分,属于萜类化合物的衍生物。1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR]是萜类物质合成途径中的关键酶。为探讨不同光照条件下滇龙胆HDR(GrHDR)基因的表达与龙胆苦苷含量之间的关系,该文以滇龙胆叶片cDNA为模板,采用PCR和TA克隆技术获得GrHDR基因序列,对该序列进行生物信息学分析和表达分析,并采用高效液相色谱法测定龙胆苦苷含量,对该基因表达与龙胆苦苷含量进行比较。结果表明:(1)GrHDR基因(GenBank登录号: KJ917165.1)全长1 398 bp,编码465个氨基酸,推定GrHDR蛋白是亲水且稳定的,相对分子质量是52 281.25 Da,理论等电点是5.32;(2)该蛋白属于LYTB蛋白家族,可能定位于叶绿体上,无信号肽,二级结构主要由α-螺旋(45.16%)、β-转角(6.24%)、无规卷曲(33.98%)、延伸链(14.62%)构成;(3)GrHDR蛋白序列与同属植物秦艽的HDR蛋白相似性最高(95.71%);(4)实时荧光定量PCR结果显示GrHDR基因在滇龙胆中的表达量为根 > 叶 > 茎,而在10%、30%、100%全光光照条件下各组织的表达量有很大差异;(5)高效液相色谱法结果显示,不同光照条件下龙胆苦苷含量一致,均为根 > 叶 > 茎,其中100%全光光照下,药用部位根中龙胆苦苷含量达到7.141%,约是30%、10%全光光照条件的两倍,但该结果与同一光照条件下GrHDR基因表达规律不完全一致。该研究为阐述HDR基因功能及其与龙胆苦苷含量的关系提供参考。     

柠条锦鸡儿F3H基因克隆及功能分析

柠条锦鸡儿为豆科灌木,对各种环境胁迫具有较强的适应能力,类黄酮是天然的抗氧化剂,花青素属类黄酮化合物,逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成,而黄烷酮3-羟化酶(F3H)是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因,命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框(ORF)为1095 bp,编码364个氨基酸,推测的蛋白质分子量为41.3 kDa,理论等电点为5.9。生物信息学分析发现,CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性,推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列,PlantCARE软件分析表明,该序列具有启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明,CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达,没有组织特异性;CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导,并且在低温胁迫下,CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述,研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。     

滇水金凤花距发育相关基因ABP的克隆及表达分析

为探究滇水金凤(Impatiens uliginosa)ABP基因的结构和表达特征,该研究以滇水金凤为材料,采用RT-PCR 技术对滇水金凤ABP基因进行克隆,运用DNAMAN和MEGA对其所编码的蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,并利用qRT-PCR分析ABP基因的时空表达模式。结果表明:(1)滇水金凤ABP基因的cDNA 全长为627 bp,编码208 aa,命名为IuABP基因,其蛋白具有Cupin超家族蛋白的典型结构。(2)同源性分析表明滇水金凤ABP基因的氨基酸序列与喜马拉雅凤仙花(I. glandulifera)、月季(Rose chinensis)、木薯(Manihot esculenta)等物种的同源性均达71%; 系统进化分析表明IuABP与喜马拉雅凤仙花(Impatiens glandulifera)聚为一支,亲缘关系最近。(3)qRT-PCR分析表明IuABP基因在滇水金凤花距发育的3个时期及2个部位均有表达。随着花距的发育,IuABP基因在滇水金凤花距檐部的表达量呈先下降后上升的趋势,在盛花期时达最高,而在花距距部的表达量逐渐下降。以上结果为进一步研究滇水金凤ABP基因在花距发育中的功能及其表达调控机制提供了一定的理论参考。     

蛇足石杉COBRA基因家族的分子生物信息学及表达分析

为探明蛇足石杉COBRA基因家族成员分子生物信息学特征及组织表达规律,该文基于蛇足石杉的全长转录组数据,通过生物信息学技术对该家族成员(HsCOBRAs)的理化性质、结构域、保守基序、顺式作用元件、基因表达量等进行分析。结果表明:(1)在蛇足石杉全长转录组中共筛选出24个HsCOBRAs家族成员,其中酸性蛋白9个,稳定蛋白11个,疏水性蛋白5个,具有跨膜结构的蛋白7个,具有信号肽的蛋白3个。(2)亚细胞定位在细胞壁、叶绿体、细胞核、细胞膜上。(3)结构分析发现HsCOBRAs有7种结构域和6种保守基序,部分成员具有高度保守的CCVS结构。(4)HsCOBRAs具有CAAT-box、TATA-box等45种顺式作用元件。(5)HsCOBRA2在叶、孢子、茎、芽胞中的表达量均最高。该研究结果可为HsCOBRAs的进一步研究及生物学功能验证等提供理论依据。     

卷叶贝母法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

为了探究卷叶贝母(Fritillaria cirrhosa)法尼基焦磷酸合酶基因(FcFPPS)是否参与甾类生物碱合成、萜类合成等代谢过程,该研究基于转录组测序结果,通过PCR技术克隆卷叶贝母FPPS基因(FcFPPS)开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过qRT-PCR检测FcFPPS基因在野生鳞茎和再生鳞茎(通过激素组合刺激获得的组织培养物)中的表达情况,以及利用煎煮法测定野生鳞茎和再生鳞茎的总生物碱含量。结果表明:获得了1 059bp的FcFPPS ORF片段,编码352个氨基酸,并与NCBI上公布的麝香百合、虎眼万年青、春兰等植物FPPS蛋白的相似性在85%以上;对FcFPPS蛋白的二级、三级结构预测发现FcFPPS蛋白主要由α螺旋构成;qRT-PCR与总生物碱含量测定结果显示FcFPPS基因的表达水平与总生物碱含量的变化趋势一致,都是再生鳞茎高于野生鳞茎。FcFPPS蛋白质特征区及同源性等生物信息学分析结合qRT-PCR的测定结果证明FcFPPS可能是一个有生物学功能的蛋白质,这为后续利用基因工程手段提高卷叶贝母中生物碱含量奠定了理论基础。     

滇龙胆8-羟香叶醇氧化还原酶基因的克隆与表达分析

滇龙胆主要药效成分为龙胆苦苷,而8-羟香叶醇氧化还原酶基因Gr8HGO是龙胆苦苷生物合成途径的结构基因。为了研究Gr8HGO基因的功能,该文克隆了滇龙胆Gr8HGO基因,并进行表达分析。结果表明:(1)共克隆到5个Gr8HGO基因,其GenBank登录号分别为KP722029.1 (Gr8HGO-1)、KP722030.1(Gr8HGO-2)、KP722031.1(Gr8HGO-3)、KP722032.1(Gr8HGO-4)、KP723852.1(Gr8HGO-5)。(2) Gr8HGO-1基因全长1 062 bp,编码353个氨基酸,其他4个基因全长1 131 bp,编码376个氨基酸;理化性质分析结果表明5个蛋白单体相对分子质量约40 kD,理论等电点在5.47～5.95之间,均为疏水稳定蛋白。(3)信号序列分析结果表明5个蛋白均不含信号肽、跨膜螺旋和叶绿体转运肽;亚细胞定位分析结果表明5个蛋白可能定位于细胞质;结构域预测结果表明除Gr8HGO-1蛋白仅包含乙醇脱氢酶N端结构域(IPR013154)和C端结构域(IPR013149)外,其他4个蛋白还包含聚酮合酶、烯酰还原酶结构域(...