柑橘叶片和果皮总蛋白质提取及双向电泳体系的建立

以春甜橘(Citrus reticulata Blanco‘Chuntianju’)果皮和叶片为材料,分别用Tris-HCl、尿素/硫脲(Thi/Urea)、三氯乙酸/丙酮(TCA)和酚(Phe)等4种方法提取柑橘总蛋白质,从蛋白质产量、单向SDS-PAGE和双向电泳等方面进行比较。结果表明,4种方法的分离效果存在较大差异,不论是以柑橘叶片还是果皮为材料,均以TCA法最好,且双向电泳图谱分辨率较好,蛋白点清晰、均匀、基本没有条纹,且蛋白点多。这说明TCA法不仅能很好地去除柑橘果皮、叶片中存在的大量干扰物质,而且还能得到稳定的蛋白点。     

卷柏总蛋白质提取方法及双向电泳条件的建立

目的:建立复苏植物——卷柏总蛋白质的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行阵列分离的双向电泳条件。方法:通过多种条件的组合与优化,建立了以物理和化学2种方法充分裂解植物组织细胞,并采用低温操作、加入PVP等去除植物组织中大量的酚类物质,最后离心去除不溶性杂质的卷柏蛋白质组双向电泳(2-DE)样品制备方法。第1向电泳为固相pH梯度等电聚焦,第2向电泳为垂直平板SDS-PAGE。结果:通过对样品制备、蛋白定量、第1向和第2向电泳、染色方法等各实验环节进行控制和优化,凝胶经考马斯亮蓝染色后,可分辨蛋白质斑点数约600个。结论:建立了卷柏总蛋白质的提取方法及蛋白质组双向电泳技术,为后续研究卷柏在干旱胁迫下的差异表达奠定了基础。     

砂藓总蛋白质提取方法的选取及双向电泳体系的建立

为进行砂藓(Racomitrium canescens)蛋白质组学的双向电泳工作,首要前提是获得质量较好的砂藓总蛋白质,并建立一套完整高效的适用于砂藓的双向电泳体系。本研究以砂藓为研究对象,比较了Tris-酚抽提法、TCA-丙酮法和试剂盒法3种蛋白质提取方法获得砂藓总蛋白质的浓度和完整性,并对砂藓中蛋白质双向电泳的运行条件进行了优化和比较。结果表明:在3种砂藓总蛋白质提取方法中,Tris-酚抽提法获得的砂藓总蛋白质浓度最高,SDS-PAGE电泳结果中条带清晰且较完整,双向电泳后获得的蛋白质点最多,是3种方法中提取砂藓蛋白质浓度最高完整性最好的方法;基于Tris-酚抽提法的基础上进一步对砂藓总蛋白质双向电泳体系进行优化,结果显示:利用pH值范围为pH 4～7的IPG胶条,蛋白质上样量为1 000μg的条件下,获得的砂藓蛋白质双向电泳图谱蛋白质点最多,图谱中可分辨的蛋白质点共(872±15)个,且低丰度蛋白质点清晰。本研究筛选出的方法获得了蛋白质点分布均匀、背景清晰、分辨率高、质量较高的双向电泳图像,建立了砂藓蛋白质组学研究体系的较好方法。本研究结果为砂藓蛋白质组学研究提供了良好基础。     

枸杞花药蛋白质组双向电泳体系的建立及应用

采用改良TCA丙酮沉淀结合Tris-HCl法提取枸杞花药蛋白质,对蛋白质裂解液成分、IPG胶条的pH范围、上样量及染色方法进行了探索.结果表明:(1)采用17 cm胶条、400 μg的上样量、含有2 mol/L硫脲的裂解液,硝酸银染色,可得到重复性好、质量高的枸杞花药蛋白2-DE图谱,枸杞花药蛋白主要集中在pH 4～7范围.(2)采用该体系分析了‘宁杞1号’和‘宁杞5号’四分体时期花药蛋白,并利用PDQuest 8.0软件在pH 4～7的2DE图谱上检测到500多个蛋白点,其中差异表达量大于2倍的蛋白有25个.     

荔枝果皮花色苷提取及稳定性研究

通过对荔枝果皮花色苷提取方法的人为盐酸甲醇为适提取剂，提取的色素液对光照和均较稳定，而ＰＨ值显著影响花色苷的稳定性。     

多子房小麦蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为建立适用于显性多子房小麦细胞质效应的蛋白质双向电泳体系,以显性多子房小麦材料DUOII与特异细胞质材料TeZhiI杂交的F1幼穗为材料,采用TCA-丙酮法提取蛋白质,并在IPG胶条长度和pH范围、SDS-PAGE凝胶浓度及蛋白质上样量等方面,对多子房小麦幼穗蛋白质双向电泳体系进行了探究与优化.结果表明,本文采用的蛋白质定量方法准确度高(R²=0.9999),确立了17 cm, pH4～7的IPG胶条, 12% SDS-PAGE分离胶,上样量为900 μg的双向电泳方法体系,获得了最适合本研究蛋白质组分析的双向电泳图谱. 经PDQuest 2DE 8.0.1软件分析,2-DE图谱上可分辨出1.444±14个清晰蛋白质点,且重复性较高(95%), 相关系数为0.960. 建立了一套适用于显性多子房小麦细胞质效应研究的蛋白质双向电泳体系.     

荔枝果皮花色苷提取及稳定性研究

通过对荔枝果皮花色苷提取方法的比较,认为盐酸甲醇为最适提取剂,提取的色素液对光照和温度均较稳定,而pH值显著影响花色苷的稳定性。     

桔小实蝇幼虫总蛋白双向电泳技术体系的建立和优化

【目的】建立和优化桔小实蝇幼虫Bactrocera dorsalis(Hendel)总蛋白的双向电泳条件。【方法】使用BPP法和3种TCA-丙酮法(TCA-丙酮-A法:直接加入裂解液磨样;TCA-丙酮-B法:样品提取液中加入40 mmol/L DTT;TCA-丙酮-C法:样品提取液中加入0.07%β-巯基乙醇)提取桔小实蝇幼虫总蛋白;使用13 cm和24 cm p H 4~7的IPG胶条分离桔小实蝇幼虫总蛋白;使用考马斯亮蓝法及硝酸银染色法对双向电泳凝胶进行染色;使用5800 MALDI-TOF-TOF MS/MS质谱分析仪对BPP法获得的特异蛋白进行质谱鉴定,并将检索数据库物种分别设为Metazoa(Animals)与Drosophila(Fruit flies)进行数据库检索。【结果】TCA-丙酮法中,TCA-丙酮-C法提取效果最好,BPP法优于所有TCA-丙酮法;使用考马斯亮蓝染色与硝酸银染色效果相当;使用24 cm胶条的蛋白分辨率明显高于13 cm胶条;检索数据库物种设为Metazoa(Animals)可获得比Drosophila(Fruit flies)更加全面的信息。【结论】使用24 cm p H 4~7的IPG胶条对BPP法提取的桔小实蝇幼虫总蛋白进行双向电泳,采用考马斯亮蓝法对双向电泳凝胶进行染色,可得到更好的双向电泳图谱,检索数据库时检索物种可优先设为Metazoa(Animals)。     

甘蔗叶片总蛋白提取及双向电泳条件的改进

针对甘蔗叶片中含有大量酚类和色素等干扰物质的现象．通过对甘蔗叶片蛋白样品制备、上样量和电泳条件等方面做了必要改进,建立了一套适用于甘蔗叶片蛋白质组分析的双向电泳（2-DE）方法。     

蝴蝶兰叶片蛋白质提取及双向电泳体系优化

通过对蛋白质提取、IPG胶条选择、上样量、水化方式、聚焦条件等方面的优化,建立蝴蝶兰叶片蛋白质的双向电泳体系。结果表明,采用酚抽提法提取蝴蝶兰叶片蛋白质的纯度较高,复溶较完全;双向电泳优化体系选用24 cm pH 3～10 NL的IPG胶条,被动水化,上样量为1.35 mg,B1程序进行等电聚焦,12%分离胶进行第二向电泳,考马斯亮蓝G-250染色。该方法获得分辨率较高、重复性较好的蝴蝶兰叶片双向电泳图谱,蛋白数点多达1163个,可以满足蝴蝶兰蛋白质组学研究和分析。     

基于SSR标记的荔枝种质遗传多样性分析

从53对本课题组自主开发设计的SSR特异引物对中筛选出22对多态性引物,对46份荔枝材料的基因组DNA进行扩增,共得到54个等位基因,其中每对引物的平均等位基因数为2.4,共获得23个特异性标记,各标记的平均观察杂合度值、平均期望杂合度和PIC值分别为0.451、0.355和0.507。其中L it6位点各数值最高,是最理想的选择标记。利用22对多态性引物对46份荔枝种质进行聚类分析,构建树状图,结果表明:大多数种质相似系数在0.63～0.95之间,说明它们之间的亲缘关系较近,并发现淮枝(广东)与淮枝(海南)两者可能为同名异物品种。     

非洲山毛豆叶片蛋白组双向电泳样品制备方法的建立

以非洲山毛豆叶片为材料,对非洲山毛豆总蛋白质3种提取方法(TCA/丙酮沉淀法、尿素/硫脲法和酚-甲醇/醋酸铵沉淀法)以及3种蛋白裂解液进行比较分析。结果表明,采用酚-甲醇/醋酸铵沉淀法提取非洲山毛豆叶片总蛋白,用蛋白裂解液(7mol/L尿素,2mol/L硫脲,4%CHAPS,40mmol/LTris-base,1%Bio-LytepH3.5-10,65mmol/LDTT)裂解蛋白1h,2-DE图谱分离到的蛋白点效果最好。此方法适合于色素、多酚及黄酮类次生代谢物含量较多的非洲山毛豆叶片总蛋白制备方法。     

Multiple shoot induction and plant regeneration in litchi (Litchi chinensis Sonn.)

Multiple shoot induction in Litchi chinensis Sonn. (litchi) has been achieved by two methods: (1) direct germination of litchi seeds in 6-benzylaminopurine (20 mg l^–1)-supplemented MS liquid medium and supported on a filter-paper bridge and (2) in planta treatment with 6-benzylaminopurine (100 μg on alternate days) of the axillary bud regions of plants germinated and maintained under sterile conditions. While the former method resulted in as many as 27.5±8.6 shoot buds from the cotyledonary node within 4 weeks, the latter yielded on average approximately 8 shoot buds from each treated node in 8 weeks. The cytokinin treatment in planta consisted of placing sterile filter paper moistened with sterile distilled water over the node and adding different concentrations of 6-benzylaminopurine. Both methods of multiple shoot induction were found to be effective for the five genotypes of litchi that were tested. The shoots elongated and rooted directly in vermiculite after a pulse treatment with IBA (25 mg/ml) for 15 min. Fungus growth which is a serious problem in litchi tissue culture, was controlled using a fungicide, Bavistin, and by eliminating organic nutrients from the growth medium. Received: 27 July 1998 / Revision received: 30 September 1998 / Accepted: 27 October 1998     

昆虫离体细胞总膜蛋白的提取及双向电泳分析

探讨适用于双向电泳的昆虫离体细胞总膜蛋白提取技术及适于双向电泳染色的高灵敏度蛋白质银染技术。以粉纹夜蛾细胞系BT1-TN-5B1-4为材料,比较了传统的Kwa法和Sigma公司的ProteoProp^TMMEMBRANE EXTRACTION KIT提取BT1-TN-5B1。离体细胞总膜蛋白,SDS—PAGE及双向电泳结果表明Sigma公司试剂盒提取的总膜蛋白效果较好,并且适用于双向电泳分析;比较了两种蛋白银染方法,确定并优化了一种灵敏度较高适于双向电泳的银染方法,得到了理想的膜蛋白2-DE图谱。     

荔枝若干重要果实品质性状的QTL分析

以‘马贵荔＇ב焦核三月红＇76株F_1代群体为试材,检测了酒石酸、苹果酸、蔗糖含量和单果重4个果实性状分离的情况。结果表明,4个性状表现为连续分布,具有数量性状的典型特征,与4个果实性状连锁的QTL位点23个,其中控制酒石酸的QTL为2个,控制苹果酸的QTL为4个,控制蔗糖的QTL为12个和控制单果重的QTL为5个。各QTL的LOD值在3.15～5.61之间,可解释13.85%～88.3%的表型变异。     

小麦根蛋白提取与双向电泳方法的优化与应用

为了建立一套适合小麦根蛋白质组分析的双向电泳系统（2-DE）,得到更加清晰的电泳图谱,本研究以小麦幼苗根系为材料,对根蛋白的提取方法、上样量等进行了优化。研究发现,上样量为1200μg时,Trizol抽提法提取的蛋白能够获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,基本满足小麦根系蛋白质组学的分析和研究。     

纯氧对荔枝果实贮藏期间果皮褐变和细胞超微结构的影响

研究了纯氧对荔枝果皮褐变和细胞超微结构的影响。结果表明,100％O2显著抑制了荔枝果皮褐变,在100％O2下贮藏6d的荔枝果实,中果皮细胞的细胞器和膜系统的完整性保持较好,而细胞膜透性较低,因此,认为高氧抑制荔枝果皮褐变与其维持细胞膜的完整性相联系。     

水牛精子蛋白质组双向电泳体系的建立和优化

建立和优化一种适合水牛精子蛋白质组学研究的双向电泳技术。以水牛精子为研究对象,比较两种不同配方的裂解液,以及不同上样量对其2-DE图谱质量的影响。结果显示,以7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、1%DTT、0.5%Cocktail of protease inhibitors为裂解液,24 cm胶条上样量200μg时,可获得较好的精子总蛋白质2-DE图谱。运用ImageMaster 2-Dplatinum分析软件检测出约500个蛋白质点,蛋白质大部分分布在等电点5-7之间,分子量范围约40-90 kD。     

巴西橡胶树胶乳黄色体蛋白提取及双向电泳方法初探

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的黄色体在胶乳凝固和保护植株过程中有重要作用。本文比较使用三氯醋酸/丙酮（TCA/ ACE）、Tris缓冲液、磷酸缓冲液提取橡胶树胶乳黄色体总蛋白的双向电泳效果。确定一种适合双向电泳的蛋白提取方法。结果表明Tris缓冲液提取法得到的双向电泳图谱可以达到300个,尤其是低丰度蛋白呈现性较好,适合提取黄色体蛋白以进行双向电泳。