应用免疫技术纯化特异性mRNA

真核基因表达的调控的研究,是分子生物学最活跃的领域之一。为了深入地对这一问题进行研究,分离特定蛋白质的信使RNA(mRNA)及其基因(DNA)是非常之必需。由于mRNA分子的长度随其所编码的多肽链的长度不同而有很大的差别,因此按其分子量的大小和密度,通过密度梯度超离心的方法,从理论上来说可以得到不同的mRNA。然而到目前为止,用此法只从特定组织或细胞中分离纯化几种蛋白质的mRNA,如分别从网织红血球、蚕丝腺以及早期海胆胚及同步的Hela细胞中分离纯化了血红蛋白、丝蛋白及组蛋白等mRNA,由于这些mRNA多半是这些组织和细胞中mRNA     

MNP—SH复合物一步法快速分离和纯化mRNA的新方法

本文建立了一种快速分离和纯化mRNA的新方法。为避免RT—PCR实验中mRNA降解问题,我们使用磁性纳米粒子,快速有效的从培齐的细胞、组织以及脐带血中分离出带有ploy（A）＋结尾的mRNA用于实验。研究结果表明,磁性纳米粒子经过修饰连接Oligo（dT）16可直接分离mRNA,其方法操作简单,快捷、省时,可有效地用于基因表达的研究。     

MNP-SH复合物一步法快速分离和纯化mRNA的新方法

本文建立了一种快速分离和纯化mRNA的新方法.为避免RT-PCR实验中mRNA降解问题,我们使用磁性纳米粒子,快速儋有效的从培养的细胞、组织以及脐带血中分离出带有ploy(A) 结尾的mRNA用于实验.研究结果表明,磁性纳米粒子经过修饰连接Oligo(dT)16可直接分离mRNA,其方法操作简单,快捷、省时,可有效地用于基因表达的研究.     

大豆胚轴信使核糖核酸(mRNA)的分离

信使核糖核酸(以下简称mRNA)是在细胞质中指导蛋白质合成的遗传物质。已有不少动物组织mRNA分离纯化,植物材料中的mRNA报导不多。我们用Oligo(dT)—纤维素柱层析法分离、纯化了大豆(Glycine max)胚轴的mRNA。引言 mRNA是从细胞核内DNA处接受遗传信息,携至细胞质中供作蛋白质生物合成的模板。但确定它存在的历史却起源于一个假说。那是1961年Jacob及Monod根据大肠杆菌乳糖操纵子控制某些诱导酶形成过程的现象而提出的学说。这个学说很快就由Brenner、Jacob和Meselson在研究感染     

几种mRNA在无细胞系统中的翻译

<正> 信使核糖核酸(mRNA)的分离与测活,在基因表达与调控、核酸结构的分析、以及基因工程等方面的研究中占有特殊的地位。一个目的基因的分离可以通过mRNA逆转录成cDNA而钩出此基因,所得基因可以进行核苷酸的序列分析,同时还可以进行调控序列的分析;又如可以借助mRNA探针从基因文库中钩出目的基因,也可以通过mRNA筛选出所需要的克隆。因此mRNA的研究已成为分子生物研究中重要手段。     

Nanog 基因在卵巢癌和卵巢肿瘤干细胞中的表达及意义

目的:探讨胚胎干细胞关键因子Nanog基因mRNA及其蛋白在卵巢癌和卵巢癌肿瘤干细胞中的表达及意义。方法:选取10例正常卵巢上皮组织、10例卵巢良性肿瘤及60例卵巢癌组织,采用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)方法和免疫组织化学PV-6000两步法检测Nanog mRNA和蛋白表达水平;采用无血清悬浮培养法从SKOV-3卵巢癌细胞株中分离培养肿瘤干细胞,流式细胞术鉴定肿瘤干细胞CD117表达,采用RT-PCR和Western Blot方法检测SKOV-3卵巢癌细胞及肿瘤干细胞中NanogmRNA及其蛋白的表达水平。结果:Nanog mRNA在卵巢癌组织中的表达水平均高于正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织(P<0.05);Nanog mRNA在不同分化程度及临床分期的卵巢癌组织中表达水平不同,低分化组高于高分化组(P<0.05);III-IV期高于I-II期(P<0.05);免疫组化结果同RT-PCR。从SKOV-3卵巢癌细胞株中成功分离出肿瘤干细胞,SKOV-3卵巢癌细胞和肿瘤干细胞Nanog mRNA相对含量分别为0.6044±0.0368,0.8736±0.0537,差异具有统计学意义(P<0.05),两种细胞Nanog蛋白相对含量分别为0.6364±0.0169 1.2788±0.0314,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论:Nanog基因在卵巢癌组织和SKOV-3细胞系中均高表达,其在组织中的表达强度与临床分期及病理分级关系密切,且在肿瘤干细胞中表达高于一般卵巢癌细胞,其与卵巢癌的发生发展关系密切,可能是卵巢癌干细胞的表面标志物,有望成为新的标志物。     

香鱼RBP基因的克隆、组织表达特征及其与盐度应激相关的表达分析

血浆视黄醇结合蛋白(Retinol binding protein,RBP)是体内将视黄醇从肝脏转运至靶组织的特异载体蛋白。最近研究发现在盐度升高时肾脏RBP蛋白表达量下降。为了进一步研究香鱼RBP基因mRNA和蛋白表达与盐度应激相关性,从香鱼、肝脏cDNA文库中获得RBP基因cDNA序列。香鱼RBP基因mRNA在肝脏中表达量最高,肾、肠、脑和鳃中表达次之。实时荧光定量RT-PCR结果显示,盐度升高时,RBP基因mRNA表达在不同组织中呈不同下降趋势,其中渗透压调节相关组织鳃、肾中,表达量下降最显著。Western blot实验证实,盐度升高时,香鱼血清RBP蛋白表达量也显著下降。揭示了RBP可能在香鱼盐度适应中有重要作用。     

牛生长激素抗体的制备及其纯化

 <正> 生长激素是垂体前叶分泌的蛋白质类激素,它在体内有多种生物学效应。近年来,对生长激素的作用机理及生长激素基因工程的研究报道很多,国内也开始了这方面的工作。我们实验室从1984年开始进行牛生长激素基因工程的研究。在这项研究中,为获得牛生长激素基因的探针,首先需要有高纯度牛生长激素mRNA。双抗体免疫沉淀法是分离、纯化特异mRNA的有效方法,采用这种方法分离牛生长激素(bGH)mRNA,需要有高纯度bGH抗体。此外,高纯度牛生长激素抗体对于检测生长激素cDNA在细菌中的表达,对于制备亲和层析     

cDNA文库技术在植物抗旱机制研究中的应用

cDNA文库是指生物不同生长发育时期特定组织或器官所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA与载体连接后形成的克隆的集合,在基因分离、克隆及功能研究中具有重要作用.就cDNA文库构建及其在植物抗旱机制研究中的应用进行综述.     

半滑舌鳎FTZ-F1cDNA克隆及表达分析

为研究性别相关基因FTZ-F1在半滑舌鳎鱼中的表达特征,采用同源克隆策略,从其精巢分离了3143bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(hsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框,66bp长的5'末端非编码区(UTR),1619bp长的3'末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列和系统发生分析表明:hsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:hsFTZ-F1mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑和头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明hsFTZ-F1可能参与了半滑舌鳎的器官形成过程。     

哺乳动物EJC的研究进展

真核生物mRNA出核转运和mRNA前体剪、mRNA降解等基因表达步骤相偶联,研究介导mRNA出核转运相关蛋白时发现蛋白复合物同时在基因转录、mRNA前体剪接,出转运及其下游步骤中出现,mRNA剪接时遗留下来的外显子－外显子连接点可作为顺式作用元件通过蛋白复合物在NMD中发挥功能,降解含有提前出现终止密码子的mRNA,本文以分离剪接后mRNA复合物（主要是EJC）各组成成分及功能进行综述。     

植物mRNA和多聚核糖体的分离

分离植物mRNA是植物分子生物学研究的重要手段之一。它直接关系到基因表达与调控的研究。还可以从mRNA获得互补DNA(cDNA),进而制备基因。真核生物的mRNA通常在其3-端含有poly(A)(多聚腺苷酸),可     

北京鸭卵对蛋白mRNA的提纯及某些性质的鉴定

 本文报道了从产卵期北京鸭输卵管中提取总RNA,经Olilo(dT)-纤维素柱层析,再经sepharose 4B柱层析步骤,得到了纯化的鸭卵清蛋白mRNA。我们建立了麦胚无细胞体系并探索了鸭卵清蛋白mRNA在此体系中翻译的最适条件。在此条件下测定了各纯化步骤的总mRNA翻译活性,并用免疫沉淀法测定其中卵清蛋白mRNA的活性。测定结果表明我们从mRNA中分离得到了纯鸭卵清蛋白mRNA。用变性的琼脂糖凝胶电泳对各纯化步骤的核酸样品进行组成分析,确定出鸭卵清蛋白mRNA的大小约为21S。     

外显子捕获法分离FRAXA位点的新表达序列

外显子捕获是近年发展起来的一种自基因组DNA分离表达序列的有效方法.我们采用以pSPL3为剪接载体的外显子捕获系统,从覆盖FRAXA位点的酵母人工染色体YAC209G4中分离到2个新外显子序列A91和D12.A91在人胎肝和骨骼肌文库中丰度较高,在肝、肾和骨髓文库中也有PCR扩增.而D12在所分析的8个cDNA文库中均未见PCR扩增产物.从骨骼肌文库中克隆到一段包含A91的315 bp的cDNA(AM4470).多种组织RNA印迹显示,AM4470与骨骼肌和心脏mRNA杂交,转录本长度均为2.8 kb.     

以胸腺嘧啶核苷酸钙盐为材料的Oligo(dT)-纤维素的制备

分离生物体内的mRNA是深入研究遗传信息翻译过程的首要条件,因而为分离mRNA所特需的Oligo(dT)—纤维素在核酸研究中极为重要。目前,一般在制备这种纤维素时,都采用胸腺嘧啶核苷酸铵盐或钠盐。但这两种原料不易多得,而胸腺嘧啶核     

β2-微球蛋白mRNA低表达在肝细胞癌免疫逃逸中的作用

目的：研究肝细胞癌（HCC）组织中人白细胞抗原（HIA）I类分子轻链β2-微球蛋白（β2-m）在肿瘤免疫逃逸中的作用,探讨肝硬化背景对肝癌组织内β2-m的mRNA水平的影响。方法：RT—PCR法检测40例肝癌和癌旁组织中β2-m的mRNA水平,并从不同角度进行分析。结果：肝癌组织中β2-m基因mRNA水平显著低于非癌组织,肝硬变背景下肝癌组织内β2-m的mRNA水平低于无肝硬化背景的肝癌组织。结论：肝癌组织中β2-m基因mRNA水平下调,可致肝癌细胞表面HIA—I类分子低表达,这一变化与肿瘤细胞的免疫逃逸相关;HCC病人的肝硬变背景在这一机制中可能起到了某种程度的促进作用。     

人喉癌组织中抑癌基因LKB1和血管内皮生长因子C的表达及意义

目的:研究人喉癌组织中抑癌基因LKB1与血管内皮生长因子C(Vascular Endothelial Growth Factor-C,VEGF-C)的表达并探讨其意义.方法:选取50例喉鳞状细胞癌患者喉癌组织及50例喉良性疾病喉组织,采取逆转录聚合酶链反应检测组织标本中LKBl mRNA与VEGF-C mRNA的表达情况,并比较不同Broder分级及临床分期等的表达差异.结果:喉癌组织中的LKB1mRNA阳性表达明显低于良性疾病喉组织,VEGF-C mRNA阳性表达明显高于良性疾病喉组织,差异具有统计学意义(P＜0.05);Broder分级LKBl mRNA在Ⅰ级中阳性表达率最高,Ⅲ级-Ⅳ级中阳性表达最低,VEGF-C mRNA阳性表达在Ⅰ级中最低,Ⅱ级-Ⅳ级中最高,差异具有统计学意义(P＜0.05);LKB1 mRNA在T1中阳性表达率最高,T3-T4中阳性最低,VEGF-C mRNA阳性表达在Tl中最低,T3-T4中最高,差异具有统计学意义(P＜0.05);LKBl mRNA、VEGF-C mRNA阳性表达与年龄无关(P＞0.05);喉癌组织中的LKBl mRNA、VEGF-C mRNA阳性表达Spearman相关性分析呈现直线负相关(r=0.648,P＜0.05).结论:喉鳞状细胞癌组织中抑癌基因LKB1、血管内皮生长因子VEGF-C的表达存在异常,并且与肿瘤的Broder分级、分期等病理情况有关,提示LKB1、VEGF-C可能在喉癌发生及发展中起到重要作用.     

人蛋白质二硫键异构酶Cdna基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人胚胎肝组织中分离纯化出总RNA,在总RNA中提取mRNA,经逆转录得到cDNA第一条链,并以之为模板和相应寡聚脱氧核苷酸为引物．进行PCR合成人蛋白质二硫键异构酶(Proteim disulfide isomerase,PDI)cDNA基因,将所得cDNA克隆到质粒pUCl8上,转化大肠杆菌DH5a细胞,进行诱导表达筛选和活性筛选。将筛选的基因克隆到载体pBV220上,在大肠杆菌细胞中表达,产物以溶解形式在胞浆中表达。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析分离,产物的纯度与活性分别为90％、1100u／g。     

实时荧光定量RT-PCR对胃癌组织中hMLH1 mRNA的检测及其临床意义

目的:探讨DNA错配修复基因hMLH1在胃癌组织中的表达水平及其临床意义.方法:应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对40例胃癌患者的癌组织、40例癌旁胃炎组织及21例慢性胃炎患者的慢性胃炎组织中hMLH1 mRNA进行定量检测,以三磷酸甘油醛脱氢酶基因(hGAPDH)为内参照.结果:胃癌组织、癌旁胃炎组织、慢性胃炎组织中hMLH1 mRNA的相对含量分别是7.23±1:11.91,3.80±5.13,2.01±1.25,三组相比差异有统计学意义(F=3.272,P=0.042),胃癌组织中hMLH1mRNA含量明显高于其他两组,癌旁胃炎组织中含量明显高于非胃癌惠者慢性胃炎组织中的含量(P＜0.05);除hMLH1 mRNA含量在有、无淋巴结转移的胃癌组织中有显著差异(P＜0.05)外,hMLH1 mRNA在胃癌组织中含量受肿瘤直径、浸润深度影响不大(P＞0.05).结论:胃癌组织和癌旁慢性胃炎组织与慢性胃炎组织相比存在hMLH1 mRNA转录差异,这种基因的转录差异可能与胃癌的发生有关,而与胃癌的发展关系不显著.     

FGFR4 mRNA及蛋白在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的:研究乳腺癌组织与乳腺癌癌旁组织中FGFR4 mRNA及蛋白的表达及其临床意义。方法:分别以实时荧光定量RT-PCR、Western blot的方法检测52例乳腺癌组织和52例癌旁正常组织中FGFR4 mRNA和蛋白的表达,分析FGFR4 mRNA和蛋白的表达与临床病理特征的相关性。结果:在乳腺癌组织中,FGFR4 mRNA及蛋白的表达均高于在乳腺癌癌旁正常组织(P0.05),并且FGFR4的表达与患者淋巴结转移和Her-2相关,而与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、ER和PR无明显相关性(P0.05)。结论:FGFR4 mRNA及蛋白在乳腺癌组织中表达升高,与淋巴结转移和Her-2有关,有望成为预测乳腺癌的转移和预后的参考指标之一。