白细胞介素6重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性过表达大鼠IL-6基因的重组逆转录病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾HEK293细胞中检测IL-6的表达。方法以大鼠骨髓间充质干细胞mRNA为模板,经PCR获得目的基因IL-6,将其定向克隆到逆转录病毒载体pSEB-3H中,构建重组逆转录病毒质粒pSEB—IL-6,经脂质体分别转染到PC12细胞和HEK293细胞中,应用Real—timePCR和ELISA的方法在mRNA和蛋白质水平检测IL-6的表达变化。继而用HEK293细胞中包装获得的含有pSEB—IL-6的病毒颗粒进一步感染PC12细胞,Real—timePCR检测,IL-6mRNA的表达水平变化。结果PCR电泳及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒载体中,其基因序列与Genbank报道一致;Real—timePCR和ELISA结果均显示,逆转录病毒质粒pSEB—IL-6转染PC12细胞和HEK293细胞后,IL-6的表达水平较对照组显著上调;经pSEB—IL-6逆转录病毒颗粒感染的PC12细胞中,IL-6mRNA表达水平较对照组提高4倍。结论成功构建了特异性表达大鼠儿-6基因的重组逆转录病毒载体pSEB—IL-6,并获得了具有感染能力的逆转录病毒颗粒,感染真核细胞后可高表达IL-6,为进一步研究IL-6的功能及其在多种疾病中的免疫调节机制提供重要的分子手段。     

重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞

【目的】研究重组猪肺表面活性蛋白A(SP-A)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的抑制作用。【方法】采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。【结果】结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度明显低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞的滴度明显低于SP-A非处理组。【结论】重组猪SP-A在体外对PRRSV的感染有明显的抑制作用,揭示SP-A具有抗PRRSV的活性。     

人ANKRD49基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究和RNA干扰靶点的鉴定

目的: 克隆人ANKRD49基因并构建其真核表达重组体,利用构建成功的ANKRD49真核表达重组体对其进行功能的初步研究,并筛选和鉴定其RNA干扰靶点. 方法: 提取人肺腺癌细胞株A549总RNA,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对ANKRD49进行扩增,扩增产物与真核表达载体p3×Flag-CMV-14同时进行双酶切,酶切产物连接后转化入感受态细胞Top10,阳性重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法(Lipofectamine^TM 2000)转染人胚肾细胞(HEK 293T),免疫印迹(Immunoblotting)和免疫荧光技术检测表达产物.免疫荧光法检测ANKRD49在宿主细胞内的定位.MTT法检测ANKRD49对宿主细胞的增殖作用.设计并合成针对人ANKRD49基因的RNA干扰靶点序列,与p3×Flag-CMV-14/ANKRD49共转染HEK 293T细胞后,Immunoblotting鉴定ANKRD49的RNA干扰靶点. 结果: RT-PCR结果显示,从A549细胞中扩增出约720 bp的片段.菌液PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49构建成功且序列正确.免疫荧光和Immunoblotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/ANKRD49的细胞中有ANKRD49的表达,蛋白质相对分子质量(Mr)约为27kDa,而转染空质粒组未见表达.MTT结果显示,ANKRD49对细胞增殖没有影响.共转染实验结果显示,1号和4号RNA干扰序列可以有效降低人ANKRD49的表达. 结论: 成功构建了真核表达重组体p3×Flag-CMV-14/ANKRD49,该蛋白质位于细胞核,不参与细胞增殖;同时鉴定出该基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究其功能奠定了基础.     

大熊猫FOXL2基因的克隆、序列分析及表达

从大熊猫基因组中克隆了FOXL2基因,并对其进行序列分析及原核表达和真核表达.将FOXL2编码区序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出FOXL2重组蛋白.成功构建了真核表达载体FOXL2-pcDNA3.1/V5-His C,并通过脂质体介导转染HEK293细胞,Western blot检测FOXL2蛋白表达.SDS-PAGE分析表明,FOXL2重组蛋白在诱导4h后表达量达到峰值,其大小约为58.9 kDa,Western blot分析结果显示重组蛋白能够被抗His单克隆抗体特异性识别.FOXL2基因的克隆及其表达为进一步进行FOXL2的活性检测以及应用研究奠定了基础.     

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用

逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity,RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染HEK293细胞的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C,rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。     

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。     

斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达.其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技...     

克隆、表达及纯化核糖体蛋白S6用于体外激酶活性检测

目的:构建40S核糖体蛋白S6的原核表达载体,表达并纯化S6蛋白,将其作为底物用于S6激酶(S6K)的体外活性测定。方法:采用RT-PCR方法从人胚肾细胞HEK293中获取S6 cDNA,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体中,进行酶切及测序鉴定;IPTG诱导GST-S6融合蛋白在大肠杆菌中表达,用谷胱甘肽亲和层析纯化GST-S6,免疫沉淀法检测该蛋白是否可作为底物用于S6K的体外激酶活性测定。结果:酶切及测序鉴定表明构建了S6原核表达载体,并表达及纯化出GST-S6融合蛋白,相对分子质量为55×103。该蛋白可用于S6K的体外激酶活性测定,特异性强。结论:S6蛋白的克隆、表达与纯化成功,可用于S6K的体外激酶活性测定,为研究S6K的功能奠定了基础。     

Ethanol sensitivity of recombinant human N-methyl-D-aspartate receptors

In this study, the ethanol sensitivity of human N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors stably expressed in L(tk-) cells, or transiently expressed in HEK 293 cells and Xenopus oocytes was determined. NMDA receptor function was measured using fura-2 calcium imaging for L(tk-) cells, whole cell voltage-clamp for HEK 293 cells, and two-electrode voltage clamp for oocytes. Ethanol inhibited NMDA receptor function in all three expression system, but was less potent for receptors expressed in L(tk-) cells. NMDA receptors composed of NR1a/2B subunits were inhibited to a greater extent by ethanol than NR1a/2A receptors when expressed in L(tk-) cells and HEK 293 cells, but not in oocytes. These results suggest that the method of receptor expression and assay system used may influence the degree of ethanol inhibition of recombinant NMDA receptors.     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达

本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

CD真核表达载C 体的构建及在 2KHE39 细胞中的表达

目的：构建含自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）的真核表达载体pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD,并进行哺乳动物细胞HEK293转染研究。方法：以本实验室保存的含CD基因全长的质粒为模版,用PcR方法扩增CD基因阅读框序列,并定向克隆到带有HAtag的pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z载体上,使目的基因与HAtag在同一阅读框。重组体质粒经EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并对插入的CD基因片段进行测序,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD用脂质体介导转染HEK293,提取细胞蛋白,western blot检测CD基因的表达情况.结果：阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）ZCD经Eco砌和BanHI双酶切后,获得约为5．5kb片段和1．3kb插入片段,序列分析表明插入的片段与GenBank发布的序列一致．western blot检测到CD基因的表达。结论：成功构建了含自杀基因CD的真核表达质粒。     

Comparison of two eukaryotic systems for the expression of VP6 protein of rotavirus specie A: transient gene expression in HEK293-T cells and insect cell-baculovirus system

The VP6 protein of rotavirus A (RVA) is a target antigen used for diagnostic assays and also for the development of new RVA vaccines. We have compared the expression of VP6 protein in human embryonic kidney (HEK293-T) cells with results obtained using a well-established insect cell-baculovirus system. The recombinant VP6 (rVP6) expressed in HEK293-T cells did not present degradation and also retained the ability to form trimers. In the insect cell-baculovirus system, rVP6 was expressed at higher levels and with protein degradation as well as partial loss of ability to form trimers was observed. Therefore, HEK293-T cells represent a less laborious alternative system than insect cells for expression of rVP6 from human RVA.     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

Expression,purification, and characterization of recombinant human neurturin secreted from the yeast Pichia pastoris

Neurturin (NTN), a potent neurotrophic factor acting specifically on dopaminergic neurons, is comprised of 102 amino acids as a mature protein. We artificially synthesized a gene for mature human NTN (hNTN) using codons preferred by the yeast Pichia pastoris. This synthesized gene, fused in frame with sequences encoding the alpha-factor signal peptide gene from Saccharomyces cerevisiae was cloned into P. pastoris expression vector pPIC9K. The recombinant plasmid pPIC9K-alpha-hNTN was then transformed into the yeast and stable multicopy recombinant P. pastoris strains were selected by G418 resistance. SDS-PAGE and Western blot assays of culture broth from a methanol-induced expression strain demonstrated that recombinant hNTN, a 16kDa glycosylated protein, was secreted into the culture medium. The recombinant protein was purified to greater than 95% using CM-Sepharose ion exchange and Superdex 75 size-exclusion chromatography steps. Bioactivity of the recombinant hNTN was confirmed by the ability of the protein to stimulate growth of nerve fibers from the dorsal root ganglia of chick embryos in vitro.