卫星RNA对黄瓜花叶病毒基因组RNA体外合成的影响

卫星ＲＮＡ对黄瓜花叶病毒基因组ＲＮＡ体外合成的影响杨海花,康良仪,赵大健,田波（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）关键词卫星ＲＮＡ,黄瓜花叶病毒,依赖ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶,体外合成利用卫星ＲＮＡ生防制剂控制田间的番茄、青椒、烟草等由黄瓜花叶病...     

卫星RNA作为黄瓜花叶病毒病生防因子的研究III．卫星RNA对黄瓜花叶病毒感染的烟叶组织中病毒双链RNA含量的影响

用3H尿嘧啶核苷标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、放射自显影等技术以及根据抗RNA酶和DNA酶的性质比较了感染黄瓜花叶病毒(CMV)及其带有卫星RNA的黄瓜花叶病毒(CMV-S52)的三生烟叶组织中病毒ds RNA含量的变化。结果表明,随接种后时间的延长,CMV-S32感染的组织中卫星RNA的ds RNA含量呈直线增长,第10天达最高峰,而病毒基因组RNA的ds RNA的含量则随时间延长而降低,这一趋势一直延续到最后一次测定。卫星RNA的双链RNA含量也比病毒基因组ds RNA高得多,从接种后的第二天的2．5倍到第10天的20倍及第l{天的近40倍,但不含卫星RNA的cMV接种后在所测定的14天内,各基因组RNA的ds RNA含量比较衡定。     

黄瓜花叶病毒株系间交叉保护作用与卫星RNA干扰作用的比较研究

用除了卫星RNA和含有卫星RNA的CMV分离物在烟草和甜椒上进行了两组不同设计的温室实验。一组在不同保护接种后,在不同时间攻强毒CMV;另一组在不同保护接种后,在同一时间攻强毒CMV。攻毒后进行寄主症状调查、病情指数统计以及强毒CMV的A蛋白夹层ELISA测定,发现交叉保护和卫星RNA干扰作用在体内都存在,但其作用时间和程度不同。交叉保护在保护接种后10—15d以前明显,15d以后很弱;而卫星RNA干扰作用则很强,尤其在保护接种10d以后保护很完全,并且维持到30d以后。     

表达黄瓜花叶病毒卫星RNA的转基因烟草耐烟草花叶病毒

表达黄瓜花叶病毒(CMV)的卫星RNA的转基因烟草可以抗CMV的侵染.为了决定这些植物对其它病毒,如烟草花叶病毒(CMV)的安全性,我们对这些植物接种CMV.结果发现 卫星RNA可减弱TMV引起的症状,井降低病情指数,然而却对TMV在植物中的积累没有明显影响.这一发现有助于对卫星RNA抗病机制的理解,有助于含卫星RNA的生防制剂及表达病毒卫星RNA的转基因植物的应用.本文在国际上首次报道卫星RNA可减弱非相关病毒引起的症状.1 材料和方法1.1 病毒及植物烟草花叶病毒(TMV),烟草G140种子及枯班三生烟种子均为中国科学院微生物研究所病毒室保存;含黄瓜花叶病毒卫星RNA-R1基因的烟草G140(烟Sat-G140)为中国科学院微生物研究所病毒室培育,所用材料为第三代种子.     

系统侵染寄主中黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的动态变化

以³²P标记的黄瓜花叶病毒（CMV）RNA3 cDNA片段和卫星RNA全长cDNA作为探针,定量测定CMV基因组RNA和卫星RNA的含量变化,结果显示：二者均具有明显的寄主效应和时间效应.在16～20℃条件下,接种不携带卫星RNA的分离物CMV-R3,15天、30天和75天时,CMV基因组RNA负荷量呈显著下降的趋势.在第15天,RNA3的负荷量以烟草>心叶烟>克里夫兰烟>番茄的顺序表现为不同寄主的显著性差异.相同条件下接种携带高拷贝卫星RNA的分离物CMV-RS,在5天和15天之间基因组RNA和卫星RNA负荷量均呈现上升的趋势,同时测得其基因组RNA和卫星的负荷量具有相似的寄主效应和时间效应,但程度不同.第15天时,二者负荷量以烟草＞心叶烟＞番茄的顺序表现寄主效应的显著性差异.在18～21℃条件下,接种携带坏死卫星RNA的CMV强毒株HC4,第5天、第10天和第15天时,基因组RNA和卫星RNA的负荷量均以番茄＞心叶烟＞烟草的顺序表现出显著性差异,并表现出明显的时间效应.不同来源CMV分离物还存在寄主选择性差异.     

黄瓜花叶病毒卫星RNA人工突变体的构建及其侵染性测定

从1个369nt的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)卫星RNA的cDNA出发,采用DNA改组技术构建人工突变体,经过体外转录,将其与不携带卫星RNA的黄瓜花叶病毒株进行假重组,鉴定突变体的生物活性,结果显示所获得的4个卫星RNA的点突变子MS1、MS5、MS6和MS11中,只有MS11仍然具有复制能力;而其他3个点突变子,尽管均只有1个位点的替换,却不能在辅助病毒作用下复制。序列比较分析发现MS11的突变位点位于卫星RNA变异区内,发生的突变与自发突变一致,其他3个突变子的突变位点发生在卫星RNA的高度保守区。而且通过侵染性试验证实突变子MS11与野生型Yi没有明显的差异。由此可推测卫星RNA序列中的高度保守区与卫星RNA的生物活性密切相关,个别碱基的突变会导致RNA二级结构的改变,进而引起其复制能力或稳定性的完全丧失。     

黄瓜花叶病毒坏死型卫星RNA的cDNA克隆和全序列分析

从田间发生坏死病害的番茄病株中分离得到黄瓜花叶病毒TN分离物,经研究证实TN分离物带有1株坏死型卫星RNA(TN-SatRNA).利用已知CMV卫星RNA的两端序列作引物扩增并克隆了TN-SatRNA的cDNA.序列分析显示TN-SatRNA全长为390个核苷酸.比较TN-SatRNA与富有代表性的CMV卫星RNA的结构表明,这几种卫星RNA中具有4个结构同源区(Ⅰ:1～81nt,Ⅱ:216～261nt,Ⅲ:278～338nt;Ⅳ:349～390nt),而在82～215nt的区域几种卫星RNA的结构变化较大.在TN-SatRNA的3’端具有已报道的坏死型卫星RNA特征性序列结构.经3’RACE方法确定TN-SatRNA的3’端自然序列,与PCR扩增引物有1个核苷酸的差别.     

黄瓜花叶病毒卫星RNA与马铃薯纺锤形块茎类病毒间序列同源性与碱基配对

黄瓜花叶病毒卫星ＲＮＡ与马铃薯纺锤形块茎类病毒间序列同源性与碱基配对田波（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）Ｇ．ＳｔｅｇｅｒＤ．Ｒｉｅｓｎｅｒ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＰｈｙｓｉｋａｌｉｓｃｈｅＢｉｏｌｏｇｉｅ,ＵｎｉｖｒｓｉｔａｔＤｕｓｓｅｌ...     

黄瓜花叶病毒卫星RNA致弱辅助病毒的机理

分析了卫星RNA致弱的黄瓜花叶病毒 (CMV)侵染的烟草叶绿体内的CP浓度与花叶症状的严重程度成正相关 .用番茄不孕病毒 (TAV)接种表达CMV卫星RNA的转基因烟草叶绿体中 ,TAV- CP含量明显比不含卫星RNA的TAV株系侵染的低 ,而在细胞质中TAV -CP含量无差别 .用完整游离叶绿体进行体外跨膜运输试验 ,CMV- CP能快速进入离体叶绿体 ,CP降低叶绿体动力学荧光光谱 .将CMV的CP基因与 1 ,5 二磷酸核酮糖羧化酶小亚基引导肽基因进行体外拼接 .借助农杆菌转化烟草 .转基因烟草表现出黄化、根系发育受抑制 ,产生类似病毒侵染的症状 .     

Genetic analysis of helper virus-specific selective amplification of cucumber mosaic virus satellite RNAs

Satellite RNAs (sat-RNAs) are small molecular parasites associated with a number of plant RNA viruses. The cucumber mosaic virus (CMV) sat-RNAs are ca. 335 nucleotides and have evolved to produce a large number of closely related sat-RNAs. Different cucumoviruses can act as helper viruses in the amplification of CMV sat-RNAs. We have found that different helper viruses show a preference for a particular sat-RNA in a mixed infection. In this study the specificity of WL47 sat-RNA amplification by LS-CMV and of D4 sat-RNA amplification by tomato aspermy virus in mixed infections was examined. Recombinant cDNA clones of D4 sat-RNA and WL47 sat-RNA were used to map the sat-RNA sequences responsible for the helper virus selection of a specific sat-RNA for amplification.Correspondence to: M.J. Roossinck     

黄瓜花叶病毒卫星RNA XJs1侵染性cDNA克隆构建及其生物学功能初步研究

利用RT_PCR的方法,获得了黄瓜花叶病毒卫星RNA XJs1的全长侵染性cDNA克隆pMSC20。序列分析显示,XJs1全长384nt(GenBank登录号:DQ070748),比较XJs1与具有代表性的CMV卫星RNA的序列结构表明,在XJs1核苷酸序列的325nt~350nt间,具有典型的坏死型卫星RNA保守序列。通过体外转录,将XJs1与不含卫星RNA的辅助病毒分离物CMV_AH组合接种普通烟和心叶烟并进行检测。初步研究结果表明,XJs1为一致弱卫星RNA。     

Characterization of Synergy between Cucumber mosaic virus and Tobacco necrosis virus in Nicotiana benthamiana

Mixed infections of Nicotiana benthamiana plants by Cucumber mosaic virus (CMV) and Tobacco necrosis virus (TNV) exhibit a synergistic interaction and result in symptom enhancement. Accumulation of CMV(+) RNA as well as capsid protein (CP) in mixed infection was considerably higher than that of singly‐infected plants. There was also a slight increase in TNV(+) RNA and CP levels in doubly infected plants. Synergistic infection by CMV‐ and TNV‐induced higher increase in the levels of malonyldialdehyde, hydrogen peroxide (H₂O₂) and more decline in the activities of catalase than singly infected ones. Both peroxidase and superoxide dismutase activities increased rapidly for the first 10 days post inoculation (dpi) in doubly‐infected plants and then declined, whereas the enzyme activities continued to increase after 10 dpi in singly infected plants and had higher enzyme activities in the late stages than that of co‐infected plants. These results suggest that synergistic infection by CMV and TNV produced severes oxidative stress in N. benthamiana plants and the synergy between the two viruses was mutual.     

Molecular Characterization and Distribution of Cucumber green mottle mosaic virus in China

Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) is an emerging virus on watermelon in China. We report here the almost complete nucleotide sequence and the characterization of the genome of a Chinese isolate (CGMMV-LN). Nucleotide sequence comparisons showed CGMMV-LN is closely related to CGMMV-KOM, with 99.4% identity. On the basis of the nucleotide sequence, a digoxigenin-labelled cDNA probe CG, complementary to the replicase gene region of CGMMV was synthesized. The specificity and sensitivity of the probe was tested. The detection limit of the method was equivalent to 0.8 μg fresh tissues infected by CGMMV. Two hundreds and eighteen watermelon samples collected from different regions in China during 2006–2007 were tested by this method. The distribution pattern of CGMMV in China during these years was revealed. The virus has spread in five provinces of China so far, including Liaoning, Hebei, Guangdong, Hubei and Shandong and might be an increasing tendency, which provides important information for CGMMV control in China.     

侵染花生的黄瓜花叶病毒CA株核酸全序列分析

对侵染花生的黄瓜花叶病毒CA(CMVCA)株系进行克隆和序列分析。CMVCARNA1全长3356个核苷酸(nt),编码分子量为111kDa的1a蛋白;RNA2全长3045nt,编码分子量为96.7kDa的2a蛋白和13.1kDa的2b蛋白;RNA3全长2219nt,编码分子量为30.5kDa的3a蛋白和分子量为24kDa的外壳蛋白(CP)。序列同源性比较表明,CMVCARNA1、2、3与CMV亚组IACMVFny、亚组IBCMVSD、亚组IICMVQ株系序列同源性,RNA1分别为91.3%、91.1%和76.5%,RNA2分别为92.1%、90%和71.2%,RNA3分别为96.1%、92.6%和74.5%;与同属花生矮化病毒(Peanutstuntvirus,PSV)RNA1、2、3序列同源性分别为67.1%、58.2%和55.7%。上述研究未发现CMVCA基因组与PSVRNA链的重组,CMVCA对花生的侵染应是该株系适应于花生的遗传变异、长期进化的结果;对RNA35′NTR结构分析以及RNA35′NTR和CP系统进化树分析表明,CMVCA属CMVIB亚组。