基因重组卡介苗活载体疫苗的研究进展

基因重组卡介苗（rBCG)是借助分子生物学技术,将外源基因导入BCG中构建而成的多价疫苗,rBCG可诱导长期的体液免疫和细胞免疫,初步的研究结果已显示出rBCG具有广阔的应用前景,有望发展成为一种经济有效的新型疫苗以预防传染病和一些肿瘤。     

液质联用技术分析比较基因重组卡介苗与传统卡介苗Ag85复合体成分

目的利用液质联用技术分析比较基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗的主要分泌型抗原Ag85复合体成分。方法分别提取基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗培养上清中的分泌蛋白,采用反相高效液相色谱(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)进行分离,并将最终得到的目的蛋白峰采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS ReflexⅢ)进行质谱分析鉴定。结果基因重组卡介苗Aeras-422与传统卡介苗培养上清分泌蛋白Ag85复合体成分有所不同,Aeras-422表达的Ag85复合体成分包括Ag85A和Ag85B两种抗原,传统卡介苗菌株仅分泌表达Ag85A抗原。结论基因重组卡介苗Aeras-422分泌Ag85复合体的能力优于传统卡介苗。为建立新型结核病疫苗的质控方法提供了数据支持。     

卡介苗的黏膜免疫途径

卡介苗(BCG)是目前预防结核病的唯一疫苗,为牛分枝杆菌减毒株,自发现以来接种达30亿剂,是应用最广泛的疫苗.尽管BCG应用了80多年,但其保护效果存在争议,从0至80%不等,原因有BCG有效抗原的丢失、环境分枝杆菌的干扰等.此外接种剂量、菌株及接种途径的影响也在受到关注.世界卫生组织(WHO)推荐使用皮内接种BCG.     

mpt64-卡介苗重组疫苗的构建、免疫原性及抗结核作用

通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原MPT64的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,采用电穿孔技术将重组质粒导入到卡介苗中,应用聚合酶链反应(PCR)扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对mpt64-卡介苗重组疫苗鉴定:成功地构建了MPT64基因pYUB295重组质粒,MPT64蛋白在卡介苗中能分泌表达....     

人白细胞介素12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗 联合免疫增强对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果

本课题旨在研究结核分枝杆菌Mtb8.4基因疫苗与人白细胞介素12（hIL-12）联合免疫小鼠所诱导的细胞免疫应答及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。40只C57BL/6N小鼠随机分为Mtb8.4基因疫苗＋hIL-12质粒组（联合免疫组）、Mtb8.4基因疫苗组、卡介苗（BCG）组、空载体组和PBS组,基因疫苗、空载体和PBS,经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106 CFU BCG免疫1次。免疫4周后,每组处死3只小鼠,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测脾细胞培养上清中细胞因子水平;乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测细胞毒性T细胞（CTL）杀伤活性。每组其余5只小鼠用结核杆菌H37Rv强毒株经尾静脉攻击,4周后,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,对小鼠部分肺和脾组织作病理切片,HE染色观察组织病变程度,Z-N染色查抗酸杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护效果。结果显示,联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2水平（分别为1493.34±8.128pg/mL、747.489±48.676pg/mL）,显著高于Mtb8.4基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少,特异性CTL杀伤活性增强,对小鼠结核杆菌感染有较好的免疫保护效果,使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数显著减少,组织病变明显减轻,其效果与卡介苗（BCG）组相当,优于Mtb8.4基因疫苗组。表明hIL-12表达质粒与Mtb8.4基因疫苗联合免疫后,能够增强Mtb8.4基因疫苗所诱导的细胞免疫应答,使Mtb8.4基因疫苗的免疫效力得到很大提高。     

EB病毒融合基因重组BCG穿梭质粒的构建及表达

分别以卡介苗(BCG)和EB病毒融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291bp的Z2A基因序列。将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS。再将EB病毒融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG。SDS-PAGE分析结果表明,构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261,电转化导入BCG,能够在BCG中分泌表达。     

特异性抗原融合蛋白结核病疫苗研究进展

结核病是一种严重危害人类健康的重大传染病,由于BCG预防效果不佳,研制新型结核病疫苗迫在眉睫。研究开发新型结核病疫苗应根据机体抗结核杆菌感染的免疫应答特点、结合BCG的不足来开展。新型结核病疫苗主要分为三类:重组BCG或重组结核菌;重组痘病毒或重组腺病毒载体疫苗;蛋白抗原亚单位或重组融合蛋白抗原亚单位疫苗。由于蛋白亚单位疫苗可以不受机体已被分枝杆菌刺激的影响,能特异性地诱导CD4+Th1细胞和CD8+细胞毒性T细胞活化,并且使用安全性好,而备受研究者的青睐。目前主要是以BCG或重组BCG初次免疫,然后选择亚单位疫苗加强免疫作为结核病疫苗序贯免疫策略。然而,单个蛋白制成亚单位疫苗,其免疫效果有限,因此将多个具有保护效果的抗原或多肽表达成融合蛋白,联合适当的佐剂,制成融合蛋白亚单位疫苗。目前,已有一些融合蛋白亚单位疫苗进入临床试验阶段,更多的融合蛋白正处于研究阶段。     

结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗与疫苗诱导的T细胞免疫记忆研究进展

牛分枝杆菌减毒活疫苗--卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)对预防严重的儿童结核病有效,但其免疫保护效率随儿童年龄增长而降低。BCG不能提供终身免疫保护可能与其诱导的记忆性T细胞主要是寿命较短的效应记忆性T细胞有关。新型结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗将有效的抗原有机组合起来,在适宜的疫苗佐剂辅助下诱导Th1型免疫应答。动物实验表明,增加抗原谱可有效提高亚单位疫苗的保护效率。更重要的是,亚单位疫苗在体内持续时间较短,可诱导寿命较长的中央记忆性T细胞,提供比BCG更持久的免疫保护力。记忆性T细胞的分化受抗原特性与剂量、细胞因子、转录因子及雷帕霉素等的调控。对亚单位疫苗及其诱导的免疫记忆进行研究将对新型结核分枝杆菌疫苗的设计与评价产生积极影响。     

EGFP标记柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗的构建及其在鸡体内的分布

鸡球虫病给禽类养殖业带来重大经济影响。本实验利用DNA重组技术将柔嫩艾美尔球虫保护性抗原基因rhomboid和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因串连,将其克隆到BCG中,构建EGFP标记柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗pMV361-Rho／EGFP。将rBCG口服免疫6日龄雏鸡,一周后剖杀,取肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官制作冰冻切片,激光共聚焦显微镜观察各组织器官rhomboid表达情况。另分别于免疫后7,14,21,28天提取肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官总RNA,实时定量RT-PCR方法检测rhomboid目的基因转录情况,比较各时期组织器官rhomboid基因表达量。结果显示,免疫一周后,用激光共聚焦显微镜观察到在肝、脾、肺、肾、盲肠各组织器官中均有EGFP表达。实时定量RT-PCR结果显示,免疫14天后rhomboid基因表达量达到高峰,随后开始下降,至28天后消失。本研究为重组卡介苗疫苗作为抗球虫疫苗的研究奠定基础。     

小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应

目的研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性。方法将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只。BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次。NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次。在免疫的第2周,4周及最后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平。同时,最后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应。结果构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究。     

卡介苗载体及其在疫苗研究中的应用

卡介苗是发展多价疫苗最好的载体之一.把外源基因导入卡介苗有3种途径:一是分枝杆菌噬菌体衍生的基因转移系统;二是分枝杆菌质粒衍生的基因转移系统;三是同源重组基因转移系统.重组卡介苗多价疫苗的研制为各种疾病的预防开辟了广阔的前景.     

大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-2100的构建及应用

利用分子生物学方法,构建了大肠杆菌分枝杆菌(E.coliMycobacterium)穿梭表达质粒pBCG-2100,研究了编码日本血吸虫中国大陆株谷胱甘肽S转移酶(Glutathione Stransferase,GST)抗原基因在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)中的表达。以含人结核杆菌热休克蛋白(Heat shock protein,hsp)70基因全长序列的质粒pMT-70为模板,扩增出hsp70启动子,测序选出无错配的启动子,将其定向克隆入E.coliMycobacterium穿梭质粒pBCG-2000中,构建成E.coliMycobacterium穿梭表达质粒pBCG-2100。再将编码GST的cDNA按正确的阅读框顺序,克隆到pBCG-2100中hsp70启动子的下游,得到分枝杆菌表达质粒pBCG-GST。将pBCG-GST电转化入BCG中,筛选出重组BCG疫苗,经热诱导后所表达的重组GST(rGST)抗原,为可溶性蛋白,经纯化后,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带,其表达量占BCG菌体总蛋白的13%。Western blot提示rGST能与抗GST的抗体反应。     

改造的HPV16型E7基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

分别以卡介苗(BCG)基因组DNA及宫颈癌组织提取DNA为模板,通过PCR扩增得到19kD抗原的胞壁区及其上游调控元件(19ss)基因序列和HPV16型E7基因序列。先将19ss基因与大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261重组,得到重组质粒pMCW。再将E7基因克隆至pMCW,得到重组质粒pMCW-E7。最后用PCR引物定点诱变法突变E7基因与转化有关的位点,得到重组质粒pMCW-mE7。对重组质粒pMCW-mE7用PCR扩增、双酶切及测序鉴定证实,19ss基因及突变的E7基因正确插入穿梭质粒pMV261。成功构建了重组穿梭质粒pMCW-mE7。     

对研发新型结核病疫苗的分析和展望

结核病是公共卫生当前面临的重要问题。由于BCG预防效果不佳,研究和开发新型结核病疫苗显得必须且急迫。新型结核病疫苗的研究开发路径和观念也经历了变迁,当前主流的研发路径有重组BCG或重组结核菌、重组痘病毒或重组腺病毒载体疫苗、蛋白质亚单位或重组融合蛋白质亚单位疫苗三类,它们在疫苗效力前景,抗原选型、配方、剂型,免疫应答,疫苗生产,疫苗质量控制,临床前研究动物试验,临床试验和使用,对结核病公共卫生政策的影响等方面各有优劣。新型结核病疫苗的成功研发,还需要病原学、发病机制、免疫学和疫苗研发科学的进一步努力。     

微生物介导的恶性疟原虫PfMSP-1疫苗的研制现状

恶性疟原虫引起的恶性疟是一种严重危害人类健康的寄生虫病,采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域之一。PfMSP-1抗原是一种有效的疫苗候选分子,鼠伤寒沙门菌、卡介苗、酵母菌、根癌农杆菌、嗜热四膜菌、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等微生物经过改造后均可成为有希望的疫苗载体。本文综述了重组鼠伤寒沙门菌(rSt-PfMSP-1和rSt-PfMSP-1_(19))、重组BCG疫苗(rBCG-PfMSP-1c和rBCGPfMSP-1_(19))、重组酵母菌(rPp-PfMSP-1)、重组根癌农杆菌(rAt-PfMSP-1_(42)、rAt-PfMSP4/5和rAtPf38)、重组嗜热四膜菌(rTt-PfMSP-1_(19))、重组腺病毒(rAd5-PfMSP-1_(42)和rChAd63-PfMSP-1)、重组牛痘病毒(rVV-PfMSP-1和rVV-PfHGFSP)以及重组杆状病毒(rBDES-PfMSP-1_(19))的构建及其免疫机制的研制现状。     

sigH-rshA过表达对卡介苗菌株致病性的影响

卡介苗(Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin, BCG)是目前唯一许可的结核病预防用疫苗,但菌株间基因组水平的改变导致疫苗在保护效果、安全性等方面存在诸多差异。【目的】验证DU2Ⅲ和Ⅳ遗传型中sigH-rshA过表达与BCG菌株毒力变化的相关性。【方法】利用分子克隆技术构建了过表达sigH-rshA的重组BCG China和BCG Japan菌株,通过RT-PCR和Western blotting验证基因表达。利用巨噬细胞和重症联合免疫缺陷(server combined immune-deficiency,SCID)小鼠感染模型评价重组BCG的毒力变化;酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试验评估肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)分泌。【结果】SigH-RshA蛋白过表达能够显著促进BCG的胞内增殖,同时刺激巨噬细胞产生更高水平的TNF-α分泌;SCID小鼠试验结果显示sigH-rshA过表达能提高重组BCG对免疫缺陷小鼠的毒力。...     

卡介苗阿拉伯糖苷转移酶embC基因敲除株的构建和初步鉴定

目的采用基因敲除技术构建了卡介苗embC基因缺失株。方法从卡介苗基因组中扩增出embC基因,定向插入自杀质粒p2NIL中,切除embC基因中约1000bp片段使其失活,再定向插入标记片段,筛选鉴定阳性克隆,电穿孔转入卡介苗,筛选重组菌株。结果PCR和酶切鉴定证明构建成功用于基因打靶的置换型自杀质粒,并筛选成功获得重组卡介苗。结论获得了卡介苗embC基因敲除株,为进一步研究对卡介苗免疫活性的影响奠定了基础。     

基因重组卡介苗的优点及应用

基因重组卡介菌（rBCG）是借助分子生物学技术,将外源基因导入BCG中构建而成的多价疫苗,rBCG可诱导长期的体液免疫和细胞免疫,初步的研究结果已显示出rBCG具有广阔的应用前景,有望发展成为一种经济有效的新型疫苗以预防传染病和一些肿瘤。     

疫苗

942266现代免疫学[英]/Ra0,K.V.S.∥Curr.Sci..1993,65(12).一969～974[译自DBA,1994,13(7),94—03824] 从以下方面综述了疫苗领域的发展:i.初创和发展}ii.转折;iii.重组活载体疫苗}iv.合成肽;v.多价免疫原。重组活载体疫苗代表着有吸引力和令入激动的新方法。它的优点之一是一次免疫即可引出长期免疫性。并且,通过活载体运送疫苗可引发体液和细胞二类免疫作用,包括生l成细胞毒性T一淋巴细胞。应用最广泛的病毒载体是痘病毒。在其它可采用的细菌载体中,人结核疫苗、牛分枝杆菌(皿ycobacfeeTium boyis)BCG最有希望。这是一种最耐热的活…     

结核杆菌的免疫逃逸对保护性免疫的影响

正结核病(TB)是世界各地感染性疾病死亡的主要病因,尤其是对于HIV感染患者。为了加强BCG已触发的免疫,TB疫苗的设计和开发一直是专注于改进卡介苗(BCG)和评估表达结核分歧杆菌(Mtb)蛋白的重组体和病毒载体,但通过这些方法,卡介苗预防感染或疾病的效果并没有得到显著改善,仍处于中等水平。2016年3月7-8日,美国国家变态和传染病研究所(NIAID)召开了关于"Mtb免疫逃逸