甲基芽孢杆菌产L-苏氨酸与L-赖氨酸突变型中其氨基酸生物合成酶的鉴定

作者曾从甲基芽孢杆菌(Methylobacillus gly-cogenes ATCC21276和ATCC21371)分离得一些谷氨酸(Glu)高产菌,并又由此筛选出能产生L-苏氨酸(Thr)与L-赖氨酸(Lys)的突变型。利用20种氨基酸分别对其亲本及其突变型中涉及上述两种氨基酸生物合成的酶的反馈调节进行了研究。     

苏氨酸操纵子的克隆与诱变

本文报道用Hind I+BamHI双酶切方法,从大肠杆菌K12的野生型菌株染色体上克隆苏氮酸操纵子的三个基因(thr A,thr B和thr C)到载体pBR322上,在合成培养基上筛选带thr操纵子的转化子。所得杂种质粒pTH1经羟胺体外诱变,筛选得到抗氨基酸类似物a-氧基-β-羟基戊酸(AHV)的突变质粒pTH2和pTH3,在宿主大肠杆菌C600中产苏氨酸最比初级克隆株高20倍以上,在解除天冬氨酸激酶—高丝氨酸脱氢酶(AKI—HDI)反馈抑制的宿主大肠杆菌A56—121中产苏氨酸量可达11g／L,比初级克隆株大肠杆菌 c600(pTHl)高100倍以上。     

谷氨酸棒杆菌1dh基因的敲除

谷氨酸棒杆菌中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可催化丙酮酸转化生成乳酸.利用重叠延伸PCR的方法,获得中间缺失部分序列的dldh基因片段,将其与载体pk 18mobsacB连接,转化大肠杆菌感受态,筛选出阳性转化子后,转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032感受态细胞.分别在卡那霉素抗性平板及10％蔗糖平板上进行两次筛选,利用PCR方法鉴定,成功获得ldh基因缺失的谷氨酸棒杆菌突变株ATCC 13032-(4)ldh.应用荧光定量PCR检测,ATCC 13032-(z)ldh中的ldh基因在转录水平与野生型菌株ATCC 13032相比,相对表达量为O.ldh基因的敲除对菌株的生长造成了一定的影响.     

谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中metX基因编码蛋氨酸合成途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶,dapA基因编码赖氨酸合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶。为研究这两个基因缺失对苏氨酸积累的影响,以谷氨酸棒杆菌R102(AHVr)为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建了metX、dapA单基因缺失突变株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及双基因缺失的突变株R102ΔmetXΔdapA。对出发菌以及上述3株重组菌进行初步摇瓶发酵试验,用HPLC法测定发酵液中苏氨酸含量。结果表明,发酵72 h后,3株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58、2.38和3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%和66.3%。     

丙酮酸激酶缺陷型黄色短杆菌突变株生成赖氨酸的机制研究

<正> 黄色短杆菌(Brevibacterinm flavum)突变株№.1—231为 S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)抗性、甲硫氨酸敏感性、低活力高丝氨酸脱氢酶(HD)和丙酮酸激酶(PK)缺失的赖氨酸产生菌,由此菌株得到了对甲硫氨酸不敏感的回复突变株,它们有正常的 HD,并有与№.1—231相同的 AEC 抗性和 PK 缺失,但是它们并不比其出发菌株№.15—8产生更多的赖氯酸,而№.1—231从№.15—8得到。赖氨酸高产突变株№.22是从菌株№.1—231通过筛选对β—氟代丙酮酸(FP)的敏感株而得到,它 HD 缺失,此通过从№.1—231两次突变筛选高丝氨酸缺陷型的 HD 缺失突变株产生更多的赖氨酸。菌株№.22在试验的条件下,并不对FP 敏感。在测定的各种赖氨酸生物合成酶中,№.22比其亲株和后者 HD 缺失突变株具有较高活力的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶。菌株№.22在含有大豆水解液、甲硫氨酸和100克/升葡萄糖的培养基中培养72小时,可产50克/升赖氯酸盐酸盐。     

枯草芽孢杆菌耐盐突变株proA基因克隆及proBA基因渗透压调节功能研究

利用TaKaRaLAPCRTM试剂盒扩增枯草芽孢杆菌 931 5 1耐盐突变株proA基因的未知下游序列。根据测序结果 ,设计引物 ,克隆出发菌株和突变株全长proBA基因。将出发菌株和突变株的proBA基因分别转化大肠杆菌JM83(proBA- ) ,均能够与其功能互补。SDS PAGE分析其表达产物 ,有两条分子量分别约为 4 0kD和 4 5kD的新蛋白带出现。测定 4种转化子 (分别含有出发菌株和突变株proB基因的大肠杆菌 1 1 2 5 2转化子及proBA基因的大肠杆菌JM83转化子 )的耐盐能力。发现含有突变株proB或proBA基因转化子的耐盐能力 ,均比相应的含有出发菌株proB或proBA基因的转化子高。另外含有出发菌株和突变株的proBA基因转化子的耐盐能力 ,也均比相应的仅含proB基因的转化子高 ,表明枯草芽孢杆菌的ProA比大肠杆菌的ProA更为有效。测定所有JM83转化子胞内自由脯氨酸 ,发现其含量随盐浓度的上升而提高 ,其中含突变菌株proBA基因的转化子提高更为显著     

大肠杆菌海藻糖合成酶基因的克隆和表达

利用Ｍｕ转座子细胞内克隆了大肠杆菌海藻糖合成酶 ｏｔｓＢＡ基因,克隆频率为１．４５ ｘ １０(－３)／ Ｋａｎ(ｒ)转导子。经遗传互补、酶切和部分序列分析表明ｏｔｓＢＡ基因位于克隆质粒。亚克隆 ２．８７ｋｂ ＤＮＡ片段至不同拷贝数表达质粒并分别转化大肠杆菌ｏｔｓＢＡ基因缺失株,转化株恢复 在０．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ培养基上生长的功能,高渗透压诱导实验表明,转化株能够合成克隆基因 产物海藻糖,但合成量不受克隆质粒拷贝数影响。海藻糖良好的抗高渗能力可能在农作物育 种方面发挥重要作用。为构建含有海藻糖合成酶基因的植物表达载体,并在农杆菌的介导下 转入植物,赋予其抗高渗、耐干旱能力奠定了重要的研究基础。     

大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。     

乳糖发酵短杆菌色氨酸营养缺陷株的诱变*

用亚硝基胍(NTG)诱变乳糖发酵短杆菌(Breevibacterium lactofermentum)ATCC-13869得到34株氨基酸营养缺陷突变株。经添加生物合成代谢途径中的不同底物鉴定,突变株33为色氨酸酶基因(tnA)缺陷,突变株34为色氨酸合成酶基因(trpB trpA)缺陷。     

产丁二酸谷氨酸棒状杆菌基因缺失代谢工程菌株的构建

【目的】提高谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032厌氧条件下的丁二酸产量,并降低发酵产物中副产物的含量。【方法】以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌,首先敲除乳酸形成的关键酶乳酸脱氢酶基因(ldh),构建ldh缺失株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh;然后以缺失株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh为出发菌,敲除该菌的丙酮酸脱氢酶系的E1p酶基因(aceE),构建一株双缺失突变菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔldhΔaceE。【结果】与供试菌比较,谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh的丁二酸产量和转化率分别提高了94.9%和32%,并且主要的副产物乳酸产量由出发菌产量的63.5 g/L降低到很微量的程度。丙酮酸脱氢酶的失活并不能完全消除副产物乙酸的形成,但乙酸的产量较ATCC13032Δldh降低了37.9%,丁二酸的产量略有提高。【结论】该重组菌具有较强的丁二酸生产工业化潜力,并且该研究方法为微生物代谢育种提供参考。     

芽孢杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及表达

N-酰基高丝氨酸内酯(N—acyl—homoserine hctones．AHLs)作为细菌群体应答系统(Quorum—sensing)中的关键信号分子,其浓度是决定许多动、植物病原菌致病基因的表达的关键因子,酰基高丝氨酸内酯酶基因可以水解AHk丹子的内酯键,使．MILs失去生物活性,从而减弱致病菌的危害．该研究旨在从芽孢杆菌中克隆酰基高丝氨酸内酯酶基因并获得纯化蛋白。根据已知酰基高丝氨酸内酯酶基因的保守序列设计引物,利用PCR方法从2株芽孢杆菌的基因组DNA中克隆出阿个基因SS1和SS10。利用在基因库中进行同源比对．结果表明SS1和SS10编码的蛋白产物SS1和SS10均为酰基高丝氨酸内酯酶。将两个基因在大肠杆菌中诱导表达,通过亲和层析获得了纯化蛋白。     

利用“移树养苗”策略挖掘粤蓝链霉菌隐性活性次级代谢产物

利用适当的策略激活粤蓝链霉菌中潜在的隐性次级代谢途径,以期获得新的活性物质。以粤蓝链霉菌突变株DMR1为研究对象,该突变株的主导产物榴菌素的关键生物合成基因gra-orf1-3被敲除,不能产生榴菌素。通过改变营养条件、添加诱导物和热激等方法处理菌株,利用琼脂糖扩散法及TLC-生物显影等方法检测发酵粗提物的抑菌活性。结果显示,突变株DMR1的高氏一号和ISP3培养基发酵粗提物对枯草芽孢杆菌ATCC6633、金黄色葡萄球菌ATCC6538以及耐药的金黄色葡萄球菌ATCC43300和206具有显著抑菌活性;添加3%DMSO诱导后,高氏一号和ISP3培养基的发酵粗提物不仅对上述菌株的抑制活性增强,还具有抑制大肠杆菌ATCC8739、白色念珠菌ATCC10231以及多株耐药菌大肠杆菌和沙门氏菌的活性。粤蓝链霉菌中新发现的活性物质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌具有广泛的抗菌活性,且部分发酵粗提物对所有测试的耐药菌均具有显著活性,有可能是新型的抗生素。结果也表明"移树养苗"策略能够提高隐性活性次级代谢产物的挖掘效率。     

枯草芽孢杆菌耐盐突变株proA基因克隆proBA基因渗透压调节功能研究

利用TaKaRa LA PCRTM试剂盒扩增枯草芽孢杆菌93151耐盐突变株proA基因的未知下游序列。根据测序结果,设计引物,克隆出发菌株和突变株全长proBA基因。将出发菌株和突变株的proBA基因分别转化大肠杆菌JM83（proBA\+-）,均能够与其功能互补。SDSPAGE分析其表达产物,有两条分子量分别约为40kD和45kD的新蛋白带出现。测定4种转化子（分别含有出发菌株和突变株proB基因的大肠杆菌1.1252转化子及proBA基因的大肠杆菌JM83转化子）的耐盐能力。发现含有突变株proB或proBA基因转化子的耐盐能力,均比相应的含有出发菌株proB或proBA基因的转化子高。另外含有出发菌株和突变株的proBA基因转化子的耐盐能力, 也均比相应的仅含proB基因的转化子高, 表明枯草芽孢杆菌的ProA比大肠杆菌的ProA更为有效。测定所有JM83转化子胞内自由脯氨酸,发现其含量随盐浓度的上升而提高,其中含突变菌株proBA基因的转化子提高更为显著。     

食品上的应用

<正> 852920利用黄短杆菌丙酮酸激酶缺陷株生产赖氨酸的机理[英]/Shio,I.…//Agri.Biol.Chem.-1984,48(6).-1551～1558[译自DBA,1984,3(19),84-09224]从黄短杆菌突变菌株No.1-231[抗S.(2.氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC),对蛋氨酸敏感,低活性高丝氨酸脱氢酶和缺丙酮酸     

北京棒状杆菌AS1.299的营养缺陷型变异株生产赖氨酸的研究*

北京棒状杆菌AS1.299(Corynebacterium pekinense AS1.299)经硫酸二乙酯处理,得到的8株产赖氨酸的营养缺陷型中,要求高丝亮氨酸的4株,要求苏氨酸的2株,要求亮氨酸的1株,同时要求苏氨酸和蛋氨酸的1株。产赖氨酸能力最高者为4株要求高丝氨酸的菌株,其次是要求亮氨酸的和一株要求苏氨酸的菌株,而另一株要求苏氨酸和同时要求苏氨酸及蛋氨酸的菌株仅产少量赖氨酸。我们选取了一株赖氨酸较高的,要求高丝氨酸的变异株AS1.563,进行了摇瓶发酵条件的研究,这一菌株在含糖10%     

食品上的应用

901103 用高密度的嗜热芽孢杆菌MGA3细胞由甲醇生产L-赖氨酸[会,英]/Schendel, F. J.…∥Abstr. Annu. Meet, Am. Soc. Microbiol.-1989, 89 Meet.-316[译自DBA,1989,8(17),89-10299] 用能够利用甲醇的嗜热芽孢杆菌MGA3、Gr和NOA_2的高丝氨酸营养缺陷型和抗S-(2-氨乙基)-半胱氨酸突变株实现了有重要营养价值的氨基酸L-赖氨酸的生产。利用甲醇基本盐类培养基,并     

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI).重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8kD,与预期分子量相符.经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致.     

应用基因工程生产单细胞蛋白(SCP)

英国最大的化学企业--帝国化学工业公司最近利用基因工程,成功地研制出一种生产单细胞蛋白的细菌。原来用于生产SCP的嗜甲基杆菌(Methylophilus methylotrophus)同化氮的效率低。为了克服这一缺点,这家企业的研究人员对该菌作了基因改良,工作分两步进行;(1)使制造谷氨酸合成酶的基因变异而纯化;(2)从大肠杆菌抽取脱氢酶的基因并移入甲基养杆菌中。用此法可以大大提高甲基养杆菌的氨同化能力。     

应用基因工程生产单细胞蛋白(SCP)

英国最大的化学企业——帝国化学工业公司最近利用基因工程,成功地研制出一种生产单细胞蛋白的细菌。原来用于生产SCP的嗜甲基杆菌(Methylophilus methylotrophus)同化氮的效率低。为了克服这一缺点,这家企业的研究人员对该菌作了基因改良,工作分两步进行;(1)使制造谷氨酸合成酶的基因变异而纯化;(2)从大肠杆菌抽取脱氢酶的基因并移入甲基养杆菌中。用此法可以大大提高甲基养杆菌的氨同化能力。     

植物乳杆菌环二腺苷酸合成酶的克隆表达与活性分析

【背景】环二腺苷酸(Cyclic Diadenosine Monophosphate,c-di-AMP)是一种主要存在于革兰氏阳性菌中的重要的第二信使分子,其参与细菌的生长、生存、抗逆性等多种生理活动,但目前关于乳酸菌中c-di-AMP的研究甚少。【目的】从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到c-di-AMP合成酶基因,在大肠杆菌中进行可溶性表达并研究其体外活性。【方法】使用高效液相色谱以及质谱分析对植物乳杆菌-YRA7细胞内容物中的c-di-AMP进行检测;以植物乳杆菌-YRA7基因组DNA为模板,克隆c-di-AMP合成酶基因(lpDacA),构建重组表达载体pET-28a-lpDacA并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化后进行体外活性研究。【结果】在植物乳杆菌中检测到c-di-AMP分子;成功构建了c-di-AMP合成酶基因的重组表达质粒,该重组蛋白在大肠杆菌中得到可溶性表达;体外活性分析显示,该重组蛋白可以催化ATP生成c-di-AMP,其活性依赖于二价阳离子的存在,在Mg~(2+)存在以及碱性环境下活性较强;RHR是合成酶活性的关键基序,是环二腺苷酸合成酶与ATP的结合位点。【结论】植物乳杆菌c-di-AMP合成酶的克隆表达及活性分析为进一步研究c-di-AMP在植物乳杆菌中的作用奠定了基础。