GFP-SA融合蛋白的表达纯化及其锚定修饰肿瘤细胞的研究

目的　GFP（绿色荧光蛋白）-SA（链亲和素）双功能融合蛋白的制备及其鉴定研究,以展示我们建立的技术平台,即用含链亲和素的双功能融合蛋白对生物素化的细胞表面进行高效的锚定修饰。方法　构建原核表达载体pET24d/GFP-SA转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导重组蛋白的表达,用镍金属螯合（Ni-NTA）层析柱进行纯化。用制备的GFP-SA双功能融合蛋白,对B16肿瘤细胞已生物素化的细胞表面进行修饰,经荧光显微镜和流式细胞仪进行修饰效率分析。此外,用MTT法检测细胞表面修饰对肿瘤细胞活力及其生长情况的影响。结果　GFP-SA重组融合蛋白在大肠杆菌实现了高效表达（约占细菌总蛋白的20%）,通过纯化和复性制备的GFP-SA双功能融合蛋白具有双重活性,即：链亲和素介导的、对生物素高效特异的结合活性,和GFP发射绿色荧光的活性,并能高效修饰表面已生物素化的肿瘤细胞。此外,GFP-SA双功能融合蛋白的细胞表面修饰对细胞的活力及其生长无显著影响。结论　GFP-SA融合蛋白能高效修饰表面已生物素化的肿瘤细胞,可用作肿瘤疫苗研究的示踪蛋白及实验对照体系。     

mIL21-SA双功能融合蛋白锚定治疗膀胱癌实验研究

目的:制备链亲合素标记的鼠白细胞介素21融合蛋白(mIL21-SA),治疗小鼠表浅膀胱癌。方法:构建mIL21-SA-pET21质粒,BL21表达,Ni-NTA纯化,透析复性,Western blot鉴定,MTT法检测其对小鼠胸腺细胞的增殖作用,流式检测其对生物素化的MB49锚定修饰率。建立小鼠MB49表浅膀胱癌模型,将mIL21-SA锚定在小鼠膀胱表面进行治疗并观察小鼠存活时间。60d后对mIL21-SA治疗后存活小鼠进行二次攻击。结果:mIL21-SA可以促进T细胞增殖,且具有SA介导的高效结合已生物素化的MB49表面的功能(修饰率98.74%)。膀胱灌注60d后,mIL21-SA组有10只(10/25)存活,二次攻击后,仍有6只(6/10)存活。与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论:该实验研制了具有双重活性的mIL21-SA,mIL21-SA锚定修饰治疗表浅膀胱癌是一种有效的免疫治疗方法。     

人源TNFα的原核表达及活性测定

目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。     

重组人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的生物学活性检测

目的：评价原核表达、纯化的6×His-硫氧还蛋白（TRX）一人肿瘤坏死因子α（TNFα）抑制肽-C端抗炎酸性尾巴融合蛋白的生物学功能。方法：在大肠杆菌中分别表达带His标签的TRX对照蛋白及TRX蛋白融合的人TNFα抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,并对2种蛋白进行N^2＋金属螯合层析纯化,采用MTT法检测纯化后的蛋白及化学合成多肽抑制TNFα标准品对L929细胞的细胞毒活性。结果：与对照蛋白相比,融合蛋白人TNFα抑制肽-C端抗炎酸性尾巴及合成多肽均能拮抗TNFα标准品对L929细胞的细胞毒作用。结论：融合蛋白人TNFα抑制肽-C端抗炎酸性尾巴及合成肽均能有效拮抗TNFα的生物学作用,为今后发展抑制TNFα为主的抗炎生物药物奠定了基础。     

SA-hIL2双功能融合蛋白的研制及其生物学鉴定

目的：制备链亲和素标记的人白细胞介素-2(SA-hIL2)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法：构建SA-L-IL2-pET24重组表达质粒,在大肠杆菌中表达SA-hIL2融合蛋白,对表达的SA-hIL2融合蛋白采用镍金属螯合（Ni-NTA）层析柱进行纯化,透析复性。CCK-8法检测SA-hIL2融合蛋白对PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性,流式细胞仪分析SA-hIL2融合蛋白对生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面锚定修饰效率。结果：SA-hIL2在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体总蛋白的20％,制备的SA-hIL2融合蛋白纯度达到95％,并具有双重活性,即hIL-2促进PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性和SA介导的高效结合至已生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面的功能（表面锚定修饰效率约95％）。结论：研制的SA-hIL2融合蛋白具有双重活性,可为研制表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。     

抗CEA单链抗体与链亲和素融合基因的表达

克隆分泌CEA杂交瘤细胞重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）,以Linker连接V_H及V_L构建抗CEA单链抗体.同时以Spacer连接单链抗体和链亲和素,构建成功单链抗体和链亲和素融合基因,克隆该融合基因至原核表达载体,pET21a(+),经IPTG诱导表达出该双特异性融合蛋白.活性鉴定表明该融合蛋白具有结合CEA及生物素的双特异性.该融合蛋白在生物领域中有较广阔的应用前景.     

凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白的表达及活性鉴定

制备凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白,并鉴定其生物学活性。利用PCR技术构建tTF与链霉亲和素SA的融合基因,克隆至表达载体pET22b( ),在E.coliBL21(DE_3)中表达,镍亲和层析柱纯化tTF/SA融合蛋白。凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性,ELISA鉴定融合蛋白中SA与生物素Biotin结合的活性。获得序列正确的tTF/SA/pET22b( )重组子,融合基因在E.coliBL21(DE_3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FⅩ、引起血液凝固的能力,且能与生物素结合。融合基因已成功在E.coliBL21(DE_3)中表达,tTF/SA融合蛋白具有TF和SA活性。融合蛋白tTF/SA可作为通用效应因子,与生物素化的肿瘤组织血管特异性载体联用,实现选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的多点治疗。     

GFE-1多肽与重组人肿瘤坏死因子α融合蛋白的构建及其体外活性和体内分布研究

目的:构建 GFE-1多肽与重组人肿瘤坏死子α(rmhTNF-α)融合蛋白(GFE-1-rmhTNF),研究该融合蛋白的体外活性和体内分布.方法:利用基工程方法,将人工合成的编码 GFE-1的寡核苷酸片段连接在 rmhTNF-α序列的3'端,转入大肠杆菌中诱导表达,采用 Q-Sepharose FF 离子层析柱和 SP-Sepharose FF 阳离子层析柱纯化蛋白,SDS-PAGE 和 Western 印迹鉴定,测定该融合蛋白的体外活性,观察其在小鼠体内的分布情况.结果:构建了融合蛋白 GFE-1-rmhTNF,并在大肠杆菌中获得高效表达.体外活性实验显示,GFE-1-rmhTNF 对 L929细胞有明显的杀伤活性;体内分布实验证实,GFE-1-rmhTNF 在小鼠肺组织的富集高肝肾组织.结论:构建了融合蛋白 GFE-1-rmhTNF,可显著杀伤 L929细胞并特异性富集小鼠肺组织.     

以TNFα为基础并靶向于白细胞介素15受体的融合蛋白的构建及功能研究(英文)

IL 1 5及IL 1 5R阳性细胞在成人T淋巴细胞性白血病 (ATL)、多发性骨髓瘤及炎症性自身免疫性疾病病理过程中起着重要作用 .应用基因重组技术 ,构建、表达靶向于IL 1 5受体的两种融合蛋白 ,为研制特异的可消除IL 1 5R高表达细胞的导向药物奠定基础 .将人IL 1 5成熟肽基因及IL 1 5R拮抗剂 (IL 1 5M)基因片段分别与人工改造的人肿瘤坏死因子突变体 (TNFαM)基因按正确的阅读框架融合 ,定向克隆在pET1 6b表达载体T7启动子的下游 ,得到质粒pET IL 1 5 TNFαM和pET IL 1 5M TNFαM .从大肠杆菌相应重组菌株中通过Ni2 + NTA亲和层析分别纯化出两种融合蛋白IL 1 5 TNFαM和IL 1 5M TNFαM .IL 1 5 TNFαM和IL 1 5M TNFαM对IL 1 5R阳性红白血病细胞K5 6 2的杀伤作用分别是TNFα的 4和 1 5倍 ,两种蛋白对IL 1 5R阴性细胞系Jurkat的杀伤作用则没有明显差异且均弱于TNFα .这些结果说明 ,两种融合蛋白特别是IL 1 5受体拮抗型蛋白IL 1 5M TNFαM对与IL 1 5 IL 1 5R异常表达相关的疾病可能具有潜在的治疗价值     

铜绿假单胞菌LexA蛋白的纯化及免疫活性分析

目的：对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的LexA蛋白进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： lexA基因片段插入表达载体pET32a(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,镍离子亲合柱层析为第一步纯化,Superdex 75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定蛋白的浓度,将纯化的LexA蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗LexA血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析LexA的免疫活性。结果：LexA以包涵体形式表达,经镍离子亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.97%,表达及纯化的LexA具有良好的免疫活性。     

水蛭素融合蛋白的表达及其与靶向适配子的偶联

目的:优化表达并纯化水蛭素融合蛋白SA-H-RGD,检测其生物学活性,获得能够与生物素标记的纤维蛋白适配子G81-2结合的偶联物。方法:将序列正确的质粒p ET-44b-SA-H-RGD进行原核表达,采用不同浓度的IPTG及时间优化融合蛋白表达条件,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western-blot鉴定蛋白。通过凝血酶原时间(PT)和抗血小板聚集实验检测融合蛋白活性;之后按照生物素-G81-2:SA-H-RGD摩尔比为4:1的比例制备纤维蛋白特异性的偶联物,用凝胶迁移阻滞实验(EMSA)验证二者的偶联。结果:融合蛋白SA-H-RGD在IPTG 0.9 mmol/L、5 h时在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,纯化的融合蛋白具有延长PT的作用和抑制血小板聚集的活性,EMSA表明SA-H-RGD具有结合生物素标记的G81-2适配子的功能。结论:本研究成功地优化表达了具有抗凝血和抗血小板聚集功能的融合蛋白SA-H-RGD,获得了水蛭素融合蛋白与生物素-G81-2适配子组成的靶向偶联物。     

重组人胰岛新生相关蛋白的表达、纯化及免疫活性研究

摘要 目的：对胰岛新生相关蛋白（Islet neogenesis associated protein ,INGAP）进行表达、纯化,并检测其免疫活性。方法： INGAP基因片段插入表达载体pET22b(+),在E.coli BL21(DE3)中表达。包涵体经洗涤并用8M尿素溶解,Heparin Agrose亲合柱层析为第一步纯化,Superdex75凝胶过滤层析作为第二步精细纯化,HPLC测定INGAP蛋白的浓度,将纯化的INGAP蛋白经注射途径免疫家兔,制备兔抗INGAP血清,采用免疫双扩、ELISA及Western Blot分析INGAP的免疫活性。结果INGAP以包涵体形式表达,表达产量高达总菌体蛋白的40%左右,经Heparin Agrose亲合柱层析和凝胶过滤层析二步组合纯化目的蛋白,经HPLC测定目的蛋白的最终纯度为98.81%,表达及纯化的INGAP具有良好的免疫活性。     

基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。     

抑制肿瘤坏死因子-α的DNA适配子的筛选与鉴定

应用SELEX技术筛选能与TNF结合的DNA适配子。化学合成随机寡聚DNA库,以TNF为靶蛋白,经过12轮SELEX筛选,将所得产物克隆、测序。根据所测序列化学合成寡聚DNA适配子,用生物素_亲和素_辣根过氧化物酶显色系统检测适配子与TNF的结合活性;用鼠L929细胞检测适配子拮抗TNF活性。结果显示,所筛选到的寡聚DNA能与TNF-α高亲和力结合,并能在细胞培养中拮抗TNF-α的细胞毒活性。     

Flt3配体胞外域的原核表达纯化及活性鉴定

目的:构建pET32a(+)-hFLext原核表达载体,诱导hFLext蛋白表达、纯化及活性鉴定.方法:以人淋巴细胞cDNA文库为模板,克隆hFlext,构建pET32a(+)-hFLext重组表达载体.转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导蛋白表达,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定.细胞增殖实验检测其生物学活性.结果:成功克隆获得hFLext,并构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体.在大肠杆菌BL21,经1 mM IPTG 30℃诱导12 h,成功表达Trx-hFLext融合蛋白,主要以包涵体形式存在.经8M尿素变性包涵体蛋白,逐步透析复性,镍珠亲合层析纯化蛋白,SDS-PAGE及Western blot鉴定,成功获得高纯度的Trx-hFLext融合蛋白.细胞增殖实验证实其具有生物学活性,能够有效刺激脐血细胞增殖.结论:成功构建了pET32a(+)-hFLext重组表达载体,表达、纯化了具有生物学活性的Trx-hFLext融合蛋白,为造血干/祖细胞的体外扩增研究奠定了基础.     

TNF受体（P55）胞外区基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

TNF与多种疾病密切相关。为了获得大量具有生物学活性的可溶性TNF受体用以拮抗TNF的毒性作用,在原核表达系统中表达了TNFR（P55）的胞外区与TrxA的融合蛋白。将TNFR（P55）胞外区去信号肽的前三个结构域基因克隆入融合蛋白表达载体pET-32a,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了TrxA-TNFR融合蛋白。表达产物以包涵体形式存在,经过变性和复性,并经镍金属鳌和柱亲和层析纯化,得到了纯度较高的可溶性受体蛋白的初纯品。免疫学实验及L929细胞体外实验均表明：该蛋白具有TNFR（P55）特异的抗原性、与TNF结合的活性以及良好的抑制TNF的TNF生物学活性。     

MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中表达的研究

目的:在不影响细胞活力的前提下,通过抑制人肿瘤坏死因子受体-Fc(TNFR-Fc)融合蛋白的降解,提高其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的产量和质量。方法:通过在细胞培养过程中加入全蛋白质合成抑制剂Cycloheximide、溶酶体抑制剂Leupeptin、蛋白酶体抑制剂MG-132,验证TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞的降解途径;免疫印迹(Western blot)方法检测在细胞内TNFR-Fc融合蛋白的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测分泌表达的TNFR-Fc融合蛋白的含量。Protein A亲和层析纯化细胞培养液上清,高效液相色谱(HPLC)检测重组蛋白的纯度,并通过阻断肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的L929细胞毒作用来检测纯化的TNFR-Fc蛋白的活性。结果:TNFR-Fc在CHO细胞内,经泛素蛋白酶体途径降解,稳定表达TNFR-Fc的CHO细胞培养过程中添加50μmol/L MG-132,可以使TNFR-Fc融合蛋白的分泌表达量提高42.35%,纯化后,二聚体比例提高28.60%,并且纯化后目的蛋白的比活性也增加。结论:在不影响细胞活力、蛋白质生物学活性的前提下,添加蛋白酶体抑制剂MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达量,为进一步研究从抑制蛋白质降解途径来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达量提供了现实依据。     

抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单克隆抗体的重链可变区与人的恒定区（Ｃγ３） 连接, 制备抗癌胚抗原嵌合重链用于放免治疗及其他导向治疗, 可减少人抗鼠抗体反应（ＨＡＭＡ） 。为纯化及核素标记抗体, 将嵌合重链基因与核心链霉亲和素基因融合。融合基因在大肠杆菌得到高效表达, 表达量占菌体总蛋白的２４ ％ 。ＳＤＳＰＡＧＥ 和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为７０ ｋＤ, 与其基因编码蛋白质的理论推算值相符。以ＨＲＰ标记的生物素作为抗体进行蛋白质印迹, 在７０ ｋＤ 处可见表达条带, 表明融合蛋白能特异性地与生物素结合, 使嵌合重链经生物素柱进行廉价纯化成为可能。表达产物在胞内主要以不溶性的包含体存在, 经变性和复性处理后, ＲＩＡ 表明表达产物具有结合其特异性抗原ＣＥＡ的能力。     

生物素化FOXM1真核表达体系的构建及鉴定

建立基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达载体,利用生物素与链霉亲和素的高特异性、高亲和力的结合性质对FOXM1蛋白进行纯化,为后续鉴定其互作分子的研究奠定基础。分别构建真核表达载体pc DNA3.1-AP-FOXM1和大肠杆菌生物素连接酶Bir A真核表达载体pcDNA3.1-Bir A,将pcDNA3.1-AP-FOXM1和pcDNA3.1-BirA共转染人胚肾293T(HEK293T)细胞,用银染及Western印迹检测细胞裂解液,确定相关蛋白表达;用链霉亲和素琼脂糖珠纯化生物素标记的FOXM1,并考察FOXM1的互作蛋白是否可以同时被洗脱下来。研究发现构建的生物素标签真核表达体系能有效表达生物素化的目标蛋白FOXM1;该蛋白在Western印迹、pull-down等实验中可实现无需抗体的一步法应用;该体系可用于FOXM1互作蛋白的鉴定和功能分析。结果表明建立了基于生物素AP-tag标签的FOXM1真核表达体系,为FOXM1互作蛋白与功能的深入研究奠定了技术基础。     

人趋化因子MIP-3α的原核可溶性表达及趋化活性分析

目的:克隆人趋化因子MIP3α,进行原核表达并初步鉴定其趋化活性。方法:从人扁桃体中提取总RNA,进行RTPCR,扩增MIP3α成熟蛋白基因,重组于pET32a( )载体,转化大肠杆菌BL21TrxB(DE3),进行融合表达,Westernblot验证融合蛋白,金属离子亲和层析,肠激酶酶切,弱阳离子交换层析,得到纯化的MIP3α蛋白,趋化试验鉴定其趋化活性。结果:成功构建了MIP3α天然蛋白的硫氧还蛋白融合表达载体,表达并纯化出MIP3α蛋白,Westernblot证明融合蛋白能与羊抗人MIP3α抗体结合,纯化的MIP3α蛋白能趋化HEK293CCR6稳定转染细胞。结论:构建的天然MIP3α融合表达载体以可溶性蛋白的方式稳定表达MIP3α,初步纯化得到的MIP3α具有趋化HEK293CCR6稳定转染细胞的活性。