遗传修饰小鼠胚胎干细胞种系嵌合体小鼠的研制

利用显微注射的方法,分别将三株不同类型的经过遗传修饰的中靶ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,通过胚胎移植将注射后的囊胚引入受体小鼠子宫中,分别获得了不同整合度的嵌合体小鼠,将高碳合度小鼠与C57BL/6J小鼠杂交,对这些仔鼠进行PCR及Southern鉴定的结果表明,三株修饰后的ES细胞均能整合入生殖系,得到了棕褐色子代鼠,表明获得了种系嵌合体小鼠。     

小鼠胚胎干细胞与四倍体胚胎的嵌合

The oviducts of superovulated Kunming white females were flushed 44-46 hours after treatment with human chorionic gonadotropin to collect 1074 late two-cell-stage embryos.The embryos were placed twenty at a time between two platinum electrodes laid 1 mm apart in 0.3M mannitol in the electrode chamber.The blastomeres were fused by a short electric pulse(80V for 50μsec) applied by a pulse generator.Fusion of blastomeres was usually completed in 20-60minutes.After 25 hours of culture,most of the tetraploid embryos developed to the four-cell stage.Zonae pellucidae of 387 four-cell-stage tetraploid embryos were removed by treatment with acid Tyrode‘s buffer.The embryos were plated on an ES cell layer,After 40 hours of coculture,248 embryos aggregated with ES cells were collected and transferred into the uteri of twenty four 2.5-day pseudopregnant recipinets.Ten recipients were pregnant.but no live fetuses were born.Three pregnant recipients were routinely subject to a Caesarean section on day 18 of pregnancy and seven abnormal fetuses were obtained.The results demonstrate that ES cells derived from C57BL/6 mice are pluripotential to a certain extent.     

人抗药基因在小鼠ES细胞中的表达及嵌合体小鼠的研究

本文用磷酸钙沉淀法将含人ｍｄｒ１基因表达质粒转染到小鼠胚胎干细胞,得到了四个能稳定地在含有２００ｎｇ／ｍｌ秋水仙素培液中生长传代的细胞克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交及ＲＮＡ印迹杂交证明人ｍｏｄｒ１基因已整合到ＥＳ细胞基因组,并有表达。其中两个克隆杂交信号较强,抗药基因可随秋水仙素深度提高而扩增,表达量也随之增加。用抗该基因编码的ｐ１７０糖蛋白抗体对ＥＳ－ｍｄｒ １细胞作免疫荧光染色,证实ｐ１７０     

BALB／c小鼠胚胎干细胞系的建立及其嵌合体小鼠的获得

目的：建立BALB/c小鼠胚胎干细胞系,并用于制作嵌合体小鼠。方法：从BALB／c小鼠囊胚内分离培养内细胞团块。建系后,进行C57BL／6L小鼠受体囊胚腔注射,制作嵌合体小鼠,结果：建立了我国第一株BALB／c小鼠胚胎干细胞系,该细胞系具有典型的ES细胞形态,碱性磷酸酶强阳性,核型正常以及具有分化为三种胚层组织的能力,并已产生5只嵌合体小鼠,结论：建立的BALB／c小鼠胚胎干细胞系具有胚胎干细胞的各种特点,可用于体内外诱导分化研究,在进一步观察生殖系嵌合情况后,决定是否可应用于基因打靶等转基因动物的制作。     

人抗药基因在小鼠ES细胞中的表达及嵌合体小鼠的研究

本文用磷酸钙沉淀法将含人mdrl 基因表达质粒(pHaMDR 1/A)转染到小鼠胚胎干细胞(ES-5),得到了四个能稳定地在含有200 ng/ml 秋水仙素培液中生长传代的细胞克隆。经Southern 印迹杂交及RNA 印迹杂交证明人mdrl 基因已整合到ES 细胞基因组,并有表达。其中两个克隆杂交信号较强,抗药基因可随秋水仙素浓度提高而扩增,表达量也随之增加。用抗该基因编码的p170糖蛋白抗体对ES-mdr 1细胞作免疫荧光染色,证实p170蛋白分布于细胞表面。未发现ES-mdr 1细胞的体内、外发育潜能与亲代细胞的有何差异。但是mdr1细胞不能被RA 和HMBA 化学药物诱导分化,表明这些细胞已与亲代ES-5细胞不同,具有拮抗化学药物诱导分化的作用,其机理尚待研究。因此,ES-mdr1细胞可作为在细胞水平研究p170糖蛋白作用机理的体系,也可用以建立体外筛选拮抗抗约基因作用新手段的模型。我们也得到了含人mdr1基因的嵌合小鼠,并对它们的嵌合情况作了分析。     

品系对小鼠胚胎干细胞分离效率的影响

为了充分利用小鼠胚胎干(ES)细胞,就必须从众多小鼠品系中分离ES细胞系。本研究通过传统的成纤维细胞饲养层法,从CD-1、129/Sv、C57BL/6J和129/Sv×C57BL/6J四种不同遗传背景的小鼠中分离得到12个ES细胞系,而从KM小鼠没有得到ES细胞系。所有的ES细胞系都具有典型的ES细胞特征,AKP染色呈阳性。从四种不同遗传背景的ES细胞系得到了包含多种组织的畸胎瘤;与桑椹胚聚合后,都得到了生殖系嵌合体。结果表明:品系对小鼠ES细胞的分离有显著影响,利用129小鼠以及包含129小鼠遗传背景的杂交小鼠都较容易分离ES细胞,由ES细胞得到生殖系嵌合体的效率在不同品系间有显著差异,从杂交ES细胞比近交ES细胞中更容易得到生殖系嵌合体。     

小鼠类胚胎干细胞分离培养及用于制作嵌合体小鼠的实验研究

目的探讨分离小鼠囊胚内细胞群类胚胎干细胞及用于制作嵌合体小鼠的方法及应用价值。方法分离3.5d小鼠囊胚内细胞群的类胚胎干细胞作为供体细胞,通过显微注射方法将分离的类胚胎干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中,再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠。结果分离36枚囊胚的内细胞群类胚胎干细胞,注射256只昆明小鼠囊胚中,移植32只假孕雌鼠子宫中,获产崽2窝,共12只,其中2只获毛色嵌合体小鼠。结论采用该技术分离所获得的类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体小鼠获得成功,该方法为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径,在同种不同品系的动物改良及遗传病基因治疗中有一定的应用价值,尤其是对未能建立ES细胞系的大动物的遗传工程操作具有一定意义。     

小鼠胚胎干细胞的培养

目的:建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)的培养方法。方法:制备G418抗性的原代小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理后成滋养层细胞,将小鼠胚胎干细胞复苏后,应用含白血病抑制因子的ES细胞培养液,培养小鼠ES细胞,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态。结果:小鼠胚胎成纤维细胞生长良好,ES细胞呈克隆状生长,且保持未分化状态。结论:建立了小鼠胚胎干细胞培养的有效方法,为下一步基因打靶奠定基础。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层,培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长,细胞排列紧密,呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

小鼠孤雌胚胎干细胞集落的建立

ＥＳＴＡＢＬＩＳＨＭＥＮＴＯＦＳＴＥＭＣＥＬＬＣＯＬＯＮＩＥＳＦＲＯＭＰＡＲＴＨＥＮＯＧＥＮＥＴＩＣＡＬＬＹＤＥＲＩＶＥＤＢＬＡＳＴＯＣＹＳＴＳＯＦＭＯＵＳＥ小鼠孤雌胚胎干细胞集落的建立ＫｅｙｗｏｒｄｓＭｏｕｓｅ,Ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃｅｍ...     

ES细胞（MESPU13）嵌合体小鼠的GPI分析

为了评判小鼠ＥＳ细胞系ＭＥＳＰＵ１３的分化潜能,我们对１９只嵌合小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胰腺、生殖腺、肌肉和血液的ＧＰＩ（磷酸葡萄糖异构酶）进行了分析。在这些样品中,来源于ＥＳ细胞的Ａ型条带的检出情况和小鼠的毛色嵌合率成正比关系。当毛色嵌合率低于４０％时,除了少数小鼠的肾脏外,没有看到Ａ型的条带。当毛色嵌合率大于８５％时,几乎所有的器官组织都检测到Ａ型条带,显示了ＥＳ细胞在发育形成内、中、外胚层的细胞方面具有很高的分化潜能。另外,在毛色嵌合率大于８５％的其中的６只嵌合鼠的肌肉中,只观察到Ａ型的条带,表明这些肌肉只单独来源于ＥＳ细胞。     

四倍体补偿技术的建立及其应用

常规基因剔除小鼠的获得主要是利用ES细胞的全能性先获得嵌合体小鼠,再利用:ES细胞的生殖系传递能力,通过嵌合体与野生型小鼠的交配获得杂合子小鼠.而四倍体补偿技术则可绕过嵌合体小鼠阶段,直接获得基因修饰杂合子小鼠.利用电融合技术和Piezoelectric microinjecfion显微注射技术建立了四倍体补偿技术,小鼠四倍体胚胎的获得率(电融合率)为(93.01±l.37)%,经体外培养囊胚形成率为(82.49±2.08)%.通过显微注射方法将2种129品系小鼠来源的ES细胞(CJ7和SCR012)注射到四倍体囊胚腔中,获得了完全ES细胞来源的小鼠,ES鼠的获得率分别为2.7%和8.3%.经微卫星DNA检测,成体小鼠的10个被检测组织均为129小鼠来源的.同时,也利用基因修饰的ES细胞进行了研究,获得了2种基因修饰的完全ES细胞来源的杂合子小鼠,部分小鼠具有繁殖能力,经繁育已获得了纯合子,其中凝血因子Ⅷ基因敲除小鼠获得了预期的血友病小鼠表型.上述结果说明四倍体补偿技术可应用于基因修饰小鼠的制备.     

ES细胞体外定向分化为成熟肝细胞的实验研究

探讨了肝细胞在胚胎干细胞（ES cell）体外诱导分化系统中成熟分化的条件、机制及其鉴定方法.利用TGF, bFGF、HGF等细胞生长因子进行BALB/c小鼠ES细胞向肝细胞方向的定向诱导.利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学（ICC）和放射免疫法（RIA）动态检测肝细胞特异性基因和蛋白AFP,ALB,G6P,TAT,CK8, CK18等在培养体系中的表达,并测定肝细胞的尿素合成功能,最后测定肝细胞分化率.结果,肝细胞特异基因AFP, ALB,G6P和TAT最早分别于第3、9、11、13天表达,肝细胞特异蛋白AFP,CK8,CK18和ALB最早分别于第7、9、9和11天开始表达.第12天开始检测到尿素出现,浓度为8.3 μmol/L,并随培养时间延长而浓度逐渐增加.最后,测得生长因子诱导组肝细胞的分化率为32％,对照组肝细胞分化率为8%.说明肝细胞可以在ES细胞体外诱导分化系统中出现并成熟分化,bFGF、HGF、OSM等可以明显提高细胞分化率和成熟度,有望成为解决肝功能替代疗法中细胞来源问题的新希望.     

EGFP小鼠ES细胞来源的生殖系嵌合小鼠的获得和鉴定

生殖系嵌合体的获得是实现ES细胞介导的转基因途径的决定步骤,而嵌合体的制作及生殖系嵌合体的获得则是判定ES细胞系是否具有配子分化能力的有效方法。利用一株表达绿色荧光蛋白的杂种ES细胞系制备出嵌合体小鼠,共获得9只表达绿色荧光蛋白的嵌合体小鼠,其中有8只雄性, 1只雌性,目前均发育成健康成年小鼠。流式细胞检测显示了绿色荧光蛋白在嵌合鼠以下器官的表达情况:心(77.96±15.78) %、脾(84.06±3.60) %、肾(42.49±19.79) %、骨髓(52.02±18.78) %。昆明雌鼠与雄性嵌合鼠杂交1代(F1)毛色表型分析显示该株ES细胞具有生殖系嵌合能力。     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

Utility of a C57BL/6 ES line versus 129 ES lines for Targeted Mutations in Mice

Inbred ES lines, though useful for generating targeted mutations in mice, are used infrequently. To appreciate the relative efficiency of inbred ES lines, a C57BL/6 ES line was compared with 129 strain ES lines for effectiveness in chimera formation leading to the establishment of targeted mutations in mice. Data from a transgenic facility spanning 7 years were collected. C57BL/6 ES cells injected into Balb/c embryos results in lower coat color chimerism than do 129 ES cells injected into C57BL/6 embryos. Combined data indicate that five independent targeted C57BL/6 clones should be injected as compared to three independent 129 clones to generate enough chimeras to effectively test for germ-line transmission. Thus, although less efficient than 129 ES lines, the C57BL/6 ES line is a relatively competent line and useful for the routine generation of targeted mutations in mice on a defined genetic background.     

A Simple and Convenient Method for Preparing Chimeric Animals from Embryonic stem (ES) Cells

Gene targeting in embryonic stem (ES) cells followed by preparation of chimeric animals is the most effective method to study the function of a gene during development and differentiation. Here, we describe a cost effective and convenient method to produce chimeric animals. Cryopreserved 8–16 cell mouse embryos were aggregated with ES cells in microwell petridishes (Khillan & Bao, 1997) to obtain blastocysts. Also, freshly isolated morulas were aggregated with ES cells that were positive for the green florescent protein (GFP). After overnight culture, the blastocysts that exhibited GFP florescence were transferred to the pseudo-pregnant mothers to obtain chimeric animals. The animals displayed high degree of ES contribution and transmitted gene to their progeny after mating with the normal animals. The studies demonstrate that the aggregation with cryopreserved embryos followed by the pre-selection for a visual marker can be a high throughput and cost effective method to create chimeric animals from the gene targeted ES cells.     

人生长激素基因逆转录病毒载体的构建及其对3T3和ES细胞的转化与表达

为了研究生长激素基因在异源细胞中的表达,构建了携带人生长激素基因（ｈＧＨ）的逆转录病毒载体ｐＩＮＳ－ＧＨ,并将其导入小鼠成纤维细胞３Ｔ３和小鼠胚胎干细胞（ＥＳ细胞）ＣＣＥ中。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化３Ｔ３细胞,获得了高效表达的克隆,即用放射免疫法检测到克隆培养基中有大量的人生长激素蛋白富积,如ＧＨＳＮＣ２０,富积率高达３７８４ｎｇ／ｍｌ,而且外源基因的整合很稳定。不同的３Ｔ３转化克隆的表达率有显著的差异,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的结果表明,这种差异与外源基因整合的拷贝数无关。ｐＩＮＳ－ＧＨ转化ＣＣＥ细胞没有获得明显表达的克隆,而且外源基因的整合也不稳定。转化的ＥＳ细胞克隆总ＤＮＡ的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明,ｈＧＨ基因的确整合到细胞基因组中。目前尚未发现明显的外源ＤＮＡ重排的迹象。     

通过显微注射法构建ES细胞(MESPU 13)嵌合小鼠

为了研究一个新建的小鼠胚胎干细胞系(ES细胞系)MESPU 13,我们将ES细胞显微注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中构建嵌合鼠。在注射了2-9个ES细胞的136个囊胚中,127个囊胚(93%)经过3个小时的培养后重新出现囊胚腔。当把119个恢复的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫内时,获得63只(52.9%)出生鼠。在59只存活到可以判断毛色阶段的小鼠中,有21只(35.6%)被判定为嵌合鼠。显示了该ES细胞系具有较高的嵌合能力。